分子诊断学第十三章单基因疾病的分子诊断

分子诊断学生化教研组王松华遗传性疾病•遗传性疾病由于人体的遗传物质发生改变所引起的疾病。

能够导致遗传性疾病发生的基因称为致病基因。

根据致病基因的遗传方式可将遗传性疾病分为两大类；•①单基因病•②多基因病⏹单基因病是指一种遗传病的发生只受一对等位基因的控制。

他们的遗传方式遵循孟德尔分离定律。

单基因病通常呈现特征性家系传递格局，个别发生病例罕见，发生率不超过2%。

⏹根据控制疾病的染色体和基因性质的不同，可将人类单基因遗传病分为：常染色体遗传X连锁遗传（显性和隐性）线粒体遗传⏹用分子生物学技术检测致病基因的遗传缺陷是诊断这类疾病最根本的手段遗传性疾病中常见的分子异常⏹遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物¡ª¡ª蛋白质（或酶）的表现异常所致。

⏹基因突变主要包括点突变、片段性突变和动态性突变。

片段性突变(fragememtal mutation)核苷酸的丢失和增多⏹缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失⏹插入：外来基因片段插入某一基因序列中⏹倍增：基因内部某一段序列发生重复⏹基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起•遗传性疾病分子诊断有两种策略可供选择：1、直接诊断策略直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；2、间接诊断策略利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。

第一节血红蛋白病血红蛋白病的定义一组遗传性或基因突变导致生成Hb的珠蛋白肽链的结构或合成速率改变，从而引起功能异常所致的溶血性贫血。

•血红蛋白病可以分为二类：①由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病；②由于珠蛋白多肽链的合成速率不平衡所导致的地中海贫血。

•临床可表现溶血性贫血、高铁血红蛋白血症或因血红蛋白氧亲和力增高或减低而引起组织缺氧或代偿性红细胞增多所致紫绀。

正常Hb的组成、结构及类型结合蛋白：血红素＋珠蛋白（Heme) (globin)1条肽链＋1分子血红素→Hb单体,４个Hb单体→球形四聚体血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，珠蛋白分子是由两条α珠蛋白肽链和两条其他珠蛋白肽链组成的四聚体。

三级结构一、血红蛋白基因1 、珠蛋白基因定位类α珠蛋白Gene定位——16p13。

类β珠蛋白Gene定位——11p15。

2、珠蛋白基因排列有共同起源，排列紧密，含有假基因。

α珠蛋白Gene簇 7个基因β珠蛋白Gene簇 6个基因（一）α珠蛋白基因人类α珠蛋白基因簇位于16p13.3 ，（二）β珠蛋白基因人类β珠蛋白基因簇位于11p15.5珠蛋白基因表达特点•发育阶段特异性5¡¯¡ª¡ª3¡¯顺次表达、关闭•合成场所特异性卵黄囊、胎肝、骨髓•表达数量协调性类α、类β链维持1：1的比例总之，珠蛋白基因的表达具有时空特异性、精确的协调性珠蛋白基因在不同发育阶段表达珠蛋白基因排列与表达顺序相关。

11chr 胚胎胎儿成人16chr 5`---ε--------Gγ----Aγ------δ-------β---3`5`Hb Gower1 Hb Portland胚胎δδ2ε 2 δ2 Gγ 2δ2 Aγ 2胎儿α2Hb Gower1I HbF HbA2HbAα2ε 2 α2Gγ 2 α2δ2α2β2α2 Aγ2成人α 1H b 类型：成人Hb ： Hb A α2β2 97～98%Hb A2α2δ2 2～3%Hb F α2γ2＜1%胎儿Hb： Hb F α2γ2胚胎Hb： Hb GowerⅠζ2ε2(妊娠12周内）Hb Gower Ⅱα2ε2Hb Portland ζ2γ2二、镰状细胞贫血的分子诊断镰状细胞贫血也称为镰状细胞病，是由于β珠蛋白基因中最常的错突变引起的疾病之一。

属于隐性常染色体遗传性疾病。

可导致血红蛋白S（HbS或Hgbs）的产生，它是一种异常血红蛋白变异。

镰状细胞贫血主要发生于非洲及地中海地区、南美洲和中美洲、中东、印度和加勒比海。

我国广东、广西、福建、浙江等地均有发现。

血红蛋白S来源于突变基因，人体内一个拷贝正常基因和一个拷贝突变基因将会产生大约20%-40%的血红蛋白S，以及足够的血红蛋白A（正常血红蛋白），一般不出现任何健康问题。

这个单一的突变的拷贝具有镰状细胞特性，并且可遗传后代。

当一个人拥有两个拷贝的突变基因（纯合子）时，它们不能产生正常的血红蛋白A,而是80%-100%的血红蛋白S，引起镰状细胞性贫血。

•拥有两个S基因拷贝（SS）和那些有一个S基因拷贝、一个突变基因（SC，β地中海贫血，SD,SOArab）的都归为“镰状细性疾病”，血红蛋白基因突变的结果是血红蛋白在红细胞内的低可溶性或低流动性，并可在正常的氧气运输状态下形成聚合物。

一旦这些聚合物形成，有一定比率的细胞停留在原来的位置且形似镰刀，镰状细胞性贫血因此而得名镰状细胞病是极其多变的，有些患者无任何症状，意外情况下才发现患病，而另一些病人却有多种并发症。

其中较常见的并发症是一种所谓的“镰状细胞病疼痛危象”，包括骨骼的疼痛，尤其是身体各处的长骨。

尽管它是原发性（不明原因）的疾病，但缺氧、感染、脱水、海拔改变、极端的温度条件下都可能导致疼痛突然发作。

目前仍还不清楚镰状细胞危象的真正原因，但它出现在一些很少镰状细胞黏附于血管形成异常形状的细胞，并进一步阻塞（血管阻塞）身体里面的小静脉的情况下。

这类血管阻塞可能会导致患者在镰状细胞危象中出现疼痛。

危象的症状通常在数天至数周后消除。

疼痛危象的次数与永久性器官损伤没有什么联系。

•镰状红细胞的寿命通常是短暂的，只能维持10-20天，而正常的红细胞可以达到120天。

为了弥补差距，患者必须以比生产正常红细胞快得多的速率生产红细胞，大量幼稚红细胞的形态释放到血流中。

当机体无法满足红细胞的生产速率时，病人的贫血症状可能变得越来越严重。

血细胞计数突然减少的最常见原因是由于细小病毒B19的感染，导致了“再生障碍性危象”。

•镰状细胞性贫血三种最可怕的并发症是中风、急性胸痛综合征和感染。

中风在儿童中比在成人中更常见，10%镰状细胞性贫血的儿童会出现中风。

患者如果反复出现血管阻塞（急性胸痛综合征），就会引起肺部问题。

患者易受到感染，这是导致镰状细胞疾病患者死亡的一个主要原因。

•其他镰状细胞疾病的并发症还包括胆结石、骨坏死、肾脏疾病、感染的风险增加、小腿溃疡、视网膜病变（眼部的视网膜疾病）和异常勃起（持续勃起）。

儿童很容易出现手指发炎（指炎）和脾肿大。

（一）镰状细胞贫血的分子机制由于β珠蛋白基因中第6个密码子的序列由原来的GAG改变成GTG，导致β珠蛋白肽链的第 6位氨基酸残基由原来的谷氨酸改变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称为镰状血红蛋白（HbS）。

该血红蛋白四聚体在脱氧时，聚集成阵列，几乎变为结晶体，使红细胞发生镰变，弹性几乎丧失，无法通过直径比红细胞小的毛细血管，导致微循环阻塞，心、肺、肾脏严重损伤。

（二）镰状细胞贫血的分子诊断方法β6密码子有三种形式基因序列对应氨基酸密码子 5 6 7 5 6 7βA ···CCTGAGGAG······Pro Glu Glu···βS ···CCTGTGGAG······Pro Val Glu···βC ···CCTAAGGAG······Pro Lys Glu···Hb S Hb S镰状细胞病Hb A Hb S镰形细胞性状Glu:谷氨酸 Val:缬氨酸Hb A Hb A正常人谷氨酸Pro:肺氨酸 Lys:赖氨枝镰状细胞贫血（β globin，β6），其GAG→GTG的突变，可用RFLP或PCR-SSCP检出。

限制性内切酶MstⅡ识别序列为CCTNAGG，N为任意核苷酸。

因此β珠蛋白基因的第5、6、7密码子的中第一个核苷酸序列是该内切酶的识别位点。

发生镰状突变后该内切酶的位点消失。

•设计一对PCR引物，扩增第5、6、7密码子，限制性内切酶MstⅡ酶切扩增产物，分析酶解片断的电泳结果即可以做出诊断。

三、地中海贫血的分子诊断•地中海贫血（thalassemia）简称地贫，最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高而得名，实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。

地贫是由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白肽链合成障碍，造成α链和β链合成不平衡而导致的一类常驻见的单基因遗传达室性、溶血性贫血。

是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病，人群发生率高达 10%以上，以广东、广西为主。

地贫主要分α和β地贫两种，以α地贫较常见。

地中海贫血的发病机制在正常人红细胞中表达出等分子的α和β珠蛋白链，并能够按1:1的比例组成α2β2血红蛋白四聚体。

α地贫患者的红细胞合成的α肽链缺乏或相对于β肽链为少，导致全部或部分血红蛋白组成为β肽链同源四聚体(β4），这种血红蛋白称为血红蛋白H。

β地贫血患者的红细胞合成血红蛋白种类与前者正好相反。

•溶血机制•α-地中海贫血•α-珠蛋白合成减少，→β-珠蛋白过剩→聚集成β4（HbH）→不稳定，聚合形成HbH包涵体→红细胞变形性下降→停留在脾索→血管外溶血。

•游离β-珠蛋白不稳定，易氧化→自由基产生增加→氧化红细胞膜蛋白脂质→红细胞膜结构破坏→溶血。

•β-地中海贫血•β-珠蛋白合成减少，α-珠蛋白合成正常→二者结合后，α-珠蛋白过剩→过剩的α链珠蛋白不稳定，聚集成α-珠蛋白包涵体→粘附于红细胞膜上→红细胞变形性下降→无法通过脾窦壁孔→停留在脾索→血管外溶血。

•游离α-珠蛋白不稳定，易氧化→自由基产生增加→氧化红细胞膜蛋白脂质→红细胞膜结构破坏→溶血。

β地贫在胎儿期无特殊临床表现，可以怀孕至足月分娩，出生时与正常胎儿几无分别，多于生后6个月左右开始发病。

表现为进行性溶血性贫血，血色素可低至2-4g/dl，肝脾肿大，脸色萎黄，苍白无力。

此病目前国内外尚无有效的治疗方法，仅能依靠输血维持生命。

由于极易发生各种并发症，多于青少年期死亡，给家庭和社会带来沉重的负担。

（一）α地中海贫血α地中海贫血是由于α珠蛋白基因的缺失，或非缺失突变导致α珠球蛋白链功能异常，或合成减少而引起的一种遗传性溶血性疾病。

1、遗传特征在第16号染色体上有2个串联的α珠蛋白(α1α2）基因，这两个基因在核苷酸上有很大的同源性，这是一个不等位交换的理想模型。