临床生物化学检验5 诊断酶学 修正版

临床酶学测定的标准化 标准化途径
酶活性浓度测定的参考系统
使用推荐方法和参考方法 使用公认的酶校准物或酶参考物 建立原级参考方法 制备原级参考物 建立参考实验室网络
第三节 同工酶和亚型测定，工具酶及其应用
一、同工酶的概念及分析方法 同工酶 同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有 相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分 布和细胞定位不同的一类酶。 亚型 基因编码的产物酶从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。
第五章
诊断酶学
诊断酶学
酶促反应动力学 及血清酶概述
酶活性浓度的测 定技术
同工酶和亚型测 定，工具酶及其
应用
临床常用血清 酶、同工酶及亚
型
酶促反应动力学
酶促反应进程
同工酶的概念及 分析方法
血清酶的来源与 去路
酶活性浓度测定 方法
工具酶的指示反 应和测定方法
血清酶的生理变 异及病理生理机
制
连续检测法测定 酶活性浓度
2、血清酶的去路
血清酶主要是在血管内失活或分解的，酶的清除与血浆蛋白的清楚途径并不完全相同。 1、血清酶经蛋白酶水解的产物（多肽或氨基酸）可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨 基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外； 2、少数小分子的酶（如 AMY）可通过肾小球滤过； 3、少数以酶原的形式存在的血清酶在活化后可被肝脏清除； 4、单核巨噬细胞系统也参与血清酶的清楚。
特例
速度一半时的底物浓度。
Km 的特点：
①Km 是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、底物、温度、pH、离子强度有关，而与
酶浓度无关。
②一种酶有多种底物时，每种底物的 Km 值各不相同，所以 Km 与底物、pH 等有关。
③如有几种底物时，Km 最小的一种底物叫天然底物。
④对于同一底物，不同的酶有不同的 Km 值。
性的影响。 缺点：应做预试验，确保在酶促反应速率恒定期进行检测。 指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量，求出 酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法。 优点：无须终止酶促反应，不需添加其它成色试剂，就反应物变化的多点测定结果
连接成线，观察整个反应过程，选择线性期来计算酶活性，结果准确可靠。
pH
酶催化活性最高时反应体系的 pH 称为其最适 pH。它也不是酶的特征性常数
抑制剂 指能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质。分不可逆抑制剂、可逆性抑制剂
激活剂 使酶从无活性变为有活性，或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂
米氏方程（Michaelis-Menten equation）： 表示一个酶促反应的起始速度与底物浓度关系的速度方程：V＝Vmax[S]/（Km+[S]）
酶合成异常 酶释放增加 酶清除异常
血清酶的病理生理机制 合成减少：肝脏功能严重障碍，酶基因突变 合成增多：细胞合成增加，酶的诱导作用 大多数血清酶增高的主要原因：细胞内外酶浓度差异、酶蛋白分子量的大小、 酶的组织分布、酶在细胞内定位和存在形式 不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同，如 AMY 和 ALP 经肾脏或 胆道排出异常而致血清酶升高
⑤Km≠Ks(Ks =[E] [S]／[ES]=K2／K1)。
⑥Km 表示酶的亲和力，Km 值越小，表示亲和力越大。
二、血清酶的来源与去路
1、血清酶的来源
项目
定义
举例
血浆特 为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催 与 凝 血 有 关 的 酶 或 酶 原 、
异酶
化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入， ChE、Cp 及 LPL 等。 在一定条件下被激活起作用。
一、酶促反应动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应速率及其影响因素。这些因素包括酶浓度、底物浓度、
pH、温度、抑制剂、激活剂等。
底物浓度 当其它因素不变时，底物浓度的变化对反应速率影响的作图呈矩形双曲线
酶浓度 底物浓度远大于酶浓度时，酶浓度对反应速率的影响呈直线关系
温度
酶促反应速率最快时反应体系的温度称为其最适温度。它不是酶的特征性常数
与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶所催化的反应。 酶催化反应的能力。 底物(S)：酶所作用的物质。 产物(P)：酶促反应的生成物。 酶的激活剂: 加速酶促反应的物质。 酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。 诱导契合学说。
临床酶学分析中，以NAD（P）H/ NAD（P）+为辅酶的脱氢酶和以H2O2为底物的过氧 化物酶（POD）是常用的指示酶。干扰因素：其他酶和物质的干扰、酶的污染、非酶反应、 分析容器的污染和沉淀形成等。
方法条件的选择 测定参数的设置
标本的采集、运输与保存 干扰因素的控制
血清酶活性浓度测定条件的优化 尽可能采用连续监测法；减少步骤，化学试剂有一定纯度,双蒸 水,使用双试剂。 方法类型、波长、样品量与试剂量、稀释水量、试剂吸光度上 下限、空白速率、反应孵育时间、延迟，监测时间、底物耗尽 限额、线性范围及计算因子 F 值。 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。 其他酶和物质的干扰、酶的污染、非酶反应、分析容器的污染 和沉淀形成等。
平衡法
（终点法）
通过测定酶促反应浓度的方法，目前少用。
三、连续检测法测定酶活性浓度
直接法 间接法
连续检测法的种类 在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光 度、荧光、旋光度、PH、电导率等，从而计算出酶活性浓度。 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反 应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。
(V 为酶促反应速度，Vmax 为最大反应速度，[S]为底物浓度，Km 为米氏常数)
米 氏 方 程 ①当[S]远大于 Km 时，V=Vmax。，即零级反应。
推 导 过 程 ②当[S]远小于 Km 时，V=Vmax/ Km）[S]。
中 的 三 种 ③当 V=（l／2）Vmax 时，Km=[S]。即 Km 定义，Km =酶促反应速度为最大
第二节 酶活性浓度的测定技术
一、酶促反应进程 一个典型的酶促反应过程一般包括延滞期、线性期和非线性期三个阶段。如果将酶反应过程 中测得的[P]或[S]变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中[P]或[S]变化曲线的 斜率就代表酶促反应的速率。
延滞期 线性期 非线性期
总结
在过量的底物存在下，底物与酶结合启动酶促反应。 由于各种因素的影响，酶促反应的初始速率比较慢，经过一段时间后，反应速度加快并 到达最大，这段时间称为延滞期。一般来说，此期从几秒至几分钟，通常为 1～3min。 指酶促反应速度达到并保持恒定速率进行反应的时期。 此时，反应速率不受底物浓度的影响，底物消耗量或产物生成量与时间呈线性关系，而 单位时间内的变化速率恒定不变。此期酶活性与反应速率成正比，是酶活性测定的最佳 时期，一般为 l～5 min。 产物与反应时间不成线性关系的反应时期。 随着反应时间的延长，底物消耗增加，酶促反应速度明显下降，偏离线性而进入非线性 期。此期，酶促反应速率不再与酶活力成正比。 要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率和时间的关系，找出酶促反应速率恒定的 时间，避开延滞期、非线性反应期。
酶的免疫化学测 定
第一节 酶促反应动力学及血清酶概述
定义
分类
酶促反应 酶活性
底物与产物
激活剂与抑制 剂
酶的活性中心 酶的作用机制
酶的基本概念 是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质，除了具有蛋白质的理化性质， 还具有极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。 单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。 结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。两者结合后形成的复合物称为全酶。
酶促反应时间进程曲线
二、酶活性浓度测定方法 按反应时间分类 定时法和连续监测法 按检测方法分类 量气法、分光光度法（最常用）、荧光法
其它方法（放射性核素法、ISE、旋光法、HPLC 或化学发光法等）。
定时法
（固定时间法）
连续监测法
（速率法或动力 学法）
使酶促反应进行一段时间后，加入终止剂终止反应，测定这段时间内底物或产物的 变化量，从而计算出酶活性浓度。 优点：测定时酶促反应已终止，无需安装恒温装置，显色剂的选择可不考虑对酶活
间接法以酶偶联法常用：
A ⎯⎯Ex→ B ⎯⎯Ei→ P
（Ex 为待测酶，A 为底物，B 为中间产物。A、B 二物质的变化无法直接监测，此时可外 加第二个酶 Ei(为指示酶)，其底物为 B，反应产物为 P 可直接测定）
辅助反应：如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指 示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：
外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶。 外分泌酶：包括 P-AMY、
非血浆 特异酶
细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，随 P-LPS、前列腺 ACP 等。 着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其 细胞内酶：AST、ALT、CK 大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受 等
损，最常用于临床诊断。
A ⎯⎯Ex→ B ⎯⎯Ea→ C ⎯⎯Ei→ P
（其中，B、C 均为中间产物，Ea、Ei 都为工具酶。最后一个酶称指示酶 Ei，其他外加的酶 都为辅助酶） 酶偶联法：
即 在 反 应 体 系 中 加 入 一 个 或 几 个 工 具 酶 ，将 待 测 酶 生 成 的 某 一 产 物 转 化 为 新 的 可 直 接 测 定 的 产 物 ，当 加 入 酶 的 反 应 速 度 与 待 测 酶 反 应 速 度 达 到 平 衡 时 ，可 以 用 指 示 酶 的反应速度来代表待测酶的活性。
酶活性浓度单位的计算