实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
微生物实验微生物实验细菌形态观察细菌分布消毒灭菌细菌形态观察一、实验目的1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护2.掌握细菌的三种形态3.掌握临床常见细菌的形态及染色4.掌握细菌的特殊结构5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点二、实验原理1. 普通光学显微镜（油镜）的使用1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰3. 根据需要调节显微镜亮度2. 普通光学显微镜的维护1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内4.做好使用记录3．微生物知识1．细菌按形态分类：球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）2．细菌的基本结构细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体3．细菌的特殊结构荚膜：如肺炎双球菌鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。
如：变形杆菌为周毛菌菌毛芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体真核类：真菌、原生动物、显微藻类非细胞类：病毒、亚病毒5．真菌单细胞：圆形、芽生孢子。
如：酵母菌多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。
如：霉菌6．白假私酵母菌（白念）生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、内脏感染、CNS感染微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝7．新型隐球菌生物学性状：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性三、实验材料记号笔：1支；大镊子：1支；火柴：1盒；蜡笔：1支；试管架：1个；酒精灯：1个；接种环：1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个四、实验内容1. 观察细菌三种形态1）球菌链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌2）杆菌破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌3）螺形菌弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌2. 观察细菌的特殊结构芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌3. 绘图葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)五、实验结果绘8幅细菌镜下图，已交。
3实验三细菌革兰氏染色
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
实验⼆普通光学显微镜的使⽤及细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊实验⼆普通光学显微镜的使⽤及细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊普通光学显微镜的使⽤⼀、实验⽬的以染⾊玻⽚及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使⽤⽅法。
⼆、显微镜油镜使⽤的原理1 普通光学显微镜的基本构造（1）光学部分: 接⽬镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放⼤, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着⽀持、调节、固定等作⽤。
2 显微镜的放⼤倍数和分辨率（1）放⼤倍数=接物镜放⼤倍数×接⽬镜放⼤倍数（2）显微镜的分辨率：表⽰显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能⼒，可⽤公式表⽰为：D=λ/2n·sin(α/2 )式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55µm）n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜⼝⾓（即⼊射⾓）。
3 油镜使⽤的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻⽚与镜头之间的空⽓时，由于空⽓与玻⽚的密度不同，使光线受到曲折，发⽣散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是⼀层油（其折射率与玻⽚的相近），则⼏乎不发⽣折射，增加了视野的进光量，从⽽使物象更加清晰。
三、实验材料1 显微镜、⾹柏油、⼆甲苯、擦镜纸、吸⽔纸、盖玻⽚、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻⽚染⾊标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验⽅法与步骤1 染⾊细菌玻⽚的油镜观查（1）⽤前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调⾄物象清晰。
（4）转⼊中倍、⾼倍观察，每⼀不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：⾼倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴⼀滴⾹柏油，使油镜镜头浸⼊⾹柏油中，细调⾄看清物象为⽌。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换⽚：另换新⽚观察，必须从（3）步开始操作。
实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法
实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法生科15.2 周罡201500181104【实验目的】1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。
4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。
5.学习并掌握革兰氏染色法。
6.了解革兰氏染色原理。
7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
【实验原理】（一）普通显微镜的基本原理1.基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。
它们包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。
光学显微镜的使用及革兰氏染色
光学显微镜的使用及革兰氏染色显微镜是研究微生物所必不可少的工具。
由于显微镜的发明，帮助人类揭开了微生物世界的奥秘。
随着科学技术的不断发展，光学显微镜已从利用可见光的范围扩大到利用紫外光源及非光源的电子显微镜，从而大大地提高了显微镜的放大率和分辨率。
当今微生物学实验室中最常用的是普通光学显微镜，无论是观察微生物的个体形态还是测量微生物细胞大小都必须使用它。
因此我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保养的目的。
除暗视野显微镜和相差显微镜可用于观察活的细菌细胞外，其他普通光学显微镜大都用来观察经染色后的细菌细胞，只有经过染色的细胞才能看清其形态和构造。
因此各种染色法也是微生物工作者应掌握的基本技术。
1普通光学显微镜的使用【目的】1．了解普通光学显微镜的构造和原理。
2．正确掌握使用显微镜的方法。
【概述】微生物是肉眼看不见的微小生物，必须借助光学显微镜和电子显微镜，才能观察到。
因此，显微镜是研究微生物最基本和最重要的工具之一。
所以，掌握显微镜的使用与维护是进行微生物实验研究的基本技能。
【普通光学显微镜的基本结构】普通光学显微镜由两大部分组成，即机械部分和光学部分。
机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘、升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。
光学系统包括反光镜（或电光源）、光圈、聚光器、物镜、目镜等，作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像，使人眼可以分辨在裸眼时不能看见的细节。
物镜一般有4×、10×、40×、100×（或90×）等几种。
100×的是油镜，是微生物实验最常用的物镜。
因为目镜多为10×，所以使用油镜观察标本时，放大倍数为1000×，可以将1μm左右的细菌放大至1mm左右。
1．机械装置(1)镜座和镜臂：它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。
显微镜的使用及细胞的革兰氏染色
微生物学实验报告题目：显微镜的使用及细胞的革兰氏染色姓名：学号：年级班级：组别：同组者：时间：【实验器材】1．菌种大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草芽孢/胞杆菌16h牛肉膏蛋白胨斜面培养物。
2．溶液和试剂革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，香柏油，二甲醇等。
3．仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶，接种环，试管架，镊子，滴管。
【目的要求】1．显微镜的构造及使用。
2．学习油镜的使用、涂片、染色技术。
3．初步认识细菌形态。
4．掌握革兰氏染色法。
【实验原理】现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在普通光学显微镜通常配置的集中物镜中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。
简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。
常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
由于细菌生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。
G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
光学显微镜的使用及革兰氏染色法的实验收获
光学显微镜的使用及革兰氏染色法的实验收获
光学显微镜是一种常用的显微镜，用于观察微小物体的光学仪器。
使用光学显微镜时，首先需要将待观察的样品放置在载物片上。
然后，将载物片放置在显微镜的样品台上。
调节显微镜的照明系统，使样品得到适当的光源和光强。
接下来，调节目镜与物镜的对焦，使样品清晰可见。
通过调节物镜的倍率可以放大样品，并利用目镜观察样品细节。
革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，用于区分细菌的形态特征。
革兰氏染色法包括以下步骤：
1. 取一片已涂制细菌液的载玻片。
2. 用火焰或消毒器加热使菌液固定在玻片上。
3. 滴加革兰氏染色液（由紫色的碘锕溶液和甲基紫溶液组成）在细菌上。
4. 具有吸附作用的碘锕溶液将染色液中的紫色结晶固定在细菌细胞质内。
5. 用洗涤溶液洗去多余的染色液。
6. 滴加酒精洗涤玻片，使染色细菌板根清晰可见。
7. 用洗涤溶液冲洗掉酒精，并使玻片表面干燥。
8. 傾倒碳素閃光粉從上方入光孔並從邊角掃入细菌上空显紫色。
9. 最后，用显微镜观察细菌的形态及染色情况，常见为革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
革兰氏染色法的实验收获是区分细菌的形态特征。
通过革兰氏染色后，可以观察到不同类型的细菌细胞壁的反应，从而可以区分细菌属于革兰氏阳性细菌还是革兰氏阴性细菌。
这对于细菌鉴定和分类具有重要意义。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G )和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材1、菌种 牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h 的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器 显微镜；3、材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂 片,干 燥,固 定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水 洗,乙醇脱色,水 洗,番红复染,水 洗,干 燥,镜 检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2、挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。
病原生物学实验3显微镜的使用、标本的制备与染色观察
1、简单染色法
原理：利用单一染料对细菌进行染色的一种 方法。
用途：适用于菌体一般形态和细菌排列的观 察。
染料：多采用美蓝、结晶紫或者碱性复红等 碱性染料。
菌种：大肠杆菌、葡萄球菌斜面18-24h培养 物。
实验步骤：
①涂片： ②干燥： 涂片制备 ③固定： ④染色：滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄 膜为宜），保留染液1-2min。 ⑤水洗：倒去染液，用自来水小水流冲洗，至涂片 上流水的水无色为止。 ⑥干燥：自然干燥或吸水纸吸干。
3. 油镜的使用原理:
使用油镜要加香柏油
原因：因为油镜的透镜很小，从载玻片透过的 光线通过空气，因玻片和空气介质密度不同， 发生折射现象，使射入镜筒的光线很少，物像 不清。若在油镜与载玻片中间加入和玻片折射 率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），则 使通过的光线不致产生折射而损失，进入油镜 的光线增多，视野光亮度增强，因此能清楚的 看到物像。
菌种：伤寒杆菌8-12 h肉汤培养物 实验方法： 取凹玻片一张，用火柴杆在凹窝四周涂凡士林
少许； 取盖玻片一张，用无菌接种环取1-2滴菌液滴
加在盖玻片中央（勿使菌液流开）；
将凹玻片扣在盖玻片上，使液滴正好对 准凹玻片的窝心，然后再轻轻按下，使 盖玻片与凡士林紧密固定，迅速翻转凹 玻片；
三、实验结果及讨论
要求画图记录实验结果 列表简述三种细菌的染色结果(说明各菌的形
状、颜色和革兰氏染色反应)。 对实验进行讨论
四、思考题
1、涂片制备时固定的目的是什么？ 2、G+菌与G-菌细胞壁的区别？ 3、哪些环节会影响革兰染色结果的正确
性？其中最关键的环节是什么？
1. 普通光学显微镜的构造：
实验三革兰氏染色法
1
革兰氏染色法 （GRAM STAINING）
细菌微小、半透明，在普通
Hans Christian Gram
光学显微镜下不易识别。 将细菌染色，增加反差，便 于观察。 革兰氏染色法是细菌学中广 泛使用的一种鉴别染色法。 革兰染色在临床上有助于细 菌致病性分析及抗菌药物选 择。
4
实验步骤
染色标本制备
涂片
干燥
固定
染色
镜检
5
染色标本制备
标记：在载玻片上背面画两个圆形区域
并作标记
涂片：用接种环各加1环生理盐水，用灭
菌接种环挑取少量菌与玻片上的生理盐
水充分混匀
干燥：涂好的菌膜在室温下自然干燥。 固定：手持载玻片的一端，菌膜面向上，
在火焰最热部分迅速通过3次
6
• 滴加结晶紫覆盖菌膜，1min，流水 冲洗 初染
2
革兰染色法可基于细菌细胞壁成分和结构的不同，将 细菌分为革兰阳性菌 （G+）和革兰阴性菌 （G－）
革兰染液 第一液（初染液）： 结晶紫染液 第二液（媒染液）： 卢戈碘液 第三液（脱色液）： 95%酒精 第四液（复染液）： 石炭酸复红液
3
实验材料
菌种：表皮葡萄球菌 （SE） 大肠埃希菌 （E.coli） 器材：载玻片、生理盐水、接种环、 酒精灯、染色架 革兰染液
8
革兰染色的注意事项
水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端
流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。
选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由
于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
酒精脱色是革兰染色的关键，要掌握好脱色的时间。
显微镜的使用和革兰氏染色法
普通光学显微镜的使用及革兰氏染色法摘要：微生物的最显著特征就是个体微小，一般必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。
熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。
革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法，可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本实验只要是学习并掌握油镜的使用及革兰氏染色的方法和步骤，巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
关键词：显微镜油镜革兰氏染色法1前言1.1实验目的1.学习并掌握普通光学显微镜及油镜的原理和使用方法。
2.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌等在光学显微镜下的基本形态特征。
3.学习细菌染色的原理和方法。
4.掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
5.巩固平板划线分离法及无菌操作技术。
1.2 实验原理1.2.1 显微镜的使用在普通显微镜（图1）通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物研究最为重要，与其它物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和物镜间加滴镜油（通常用香柏油），这主要有以下两方面的原因：①增加照明亮度从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使摄入光线较少，物象显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时必须在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（ｎ＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率ｎ＝1.52）。
光线通过载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射（接物镜油浸系），使视野增加进光量，这样就能使物像更加清晰。
详见图2 ②增加显微镜的分辨率图1 图21.2.2 革兰氏染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。
实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用
实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用实验三细菌的革兰氏染色及显微镜油镜的使用革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884 年由丹麦医师Gram创立。
显微镜各接物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大 ; 反之，放大倍数小。
油镜头长低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100×等字样。
细菌体积微小，在细菌的形态学研究中，经常需要借助显微镜油镜，才能比较清楚地进行观察。
实验目的 : 掌握革兰氏染色的方法与油镜的使用方法染色原理 :通过结晶紫初染和碘液媒染后，在内形成了不溶于水的结细胞壁晶紫与碘的复合物。
G，菌 : 细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫- 碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌 : 肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫- 碘复合物溶出细胞，番红复染后呈红色。
油镜的使用原理 : 油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。
若在油镜与载玻片之间加入和玻璃折射率(n=1.52) 相近的香柏油 (n=1.515) ，则使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。
实验器材 : 大肠杆菌、枯草杆菌、染液、香柏油、二甲苯、显微镜等染色步骤1、涂片 :2、干燥 : 自然3、固定 : 首先玻片要洗干净，然后在中间滴一滴菌液，涂匀，自然晾干，注意不要用火烤 ( 变形 ) 。
干后方法是，快速在酒精灯上过3， 4 次固定，要使有菌的一面向上。
4、结晶盖涂面染 1 分钟。
5、水洗。
6、加碘液覆盖涂面媒染约 1 分钟。
7、水洗。
8、滴加 95%酒精进行脱色， 20 秒，马上水洗。
9、番红染液覆盖涂面 1 分钟。
10、水冲。
11、干燥，油镜观察。
注意事项 :1、涂片不能过厚，以便于观察;2、菌龄要适宜，枯草杆菌培养约18h, 大肠杆菌 24h。
普通光学显微镜的使用及微生物的简单染色
2、干燥
– 在空气中自然干燥或在
火焰快速通过干燥(与 热固定同步进行).
3、热固定
– 用镊子夹住涂片一端,
在火焰上连续通过几次; 以载玻片在手背上试感 觉不烫为宜.
4、染色
– 在固定的标本上加美兰
（结晶紫）染液1-2滴,染 色1min,轻轻滴加水洗; 吸干, 加半滴水, 盖上盖 玻片, 滴上半滴镜油油镜 检。 (到此实际上即为细菌普 通染色)
®请大家做好预习。
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内容提要：
实验1、观察制备好的装片来自； 实验2、每个同学自己动手单染三张 片子进行观察 ；
一、实验目的：
1.学习普通光学显微镜的构造和功能； 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法； 3.学习微生物的简单染色，观察细菌的 形态。 返回
二、实验材料：
显微镜 双层瓶
载玻片 染色剂
香柏油 滴管
超高压透射 电子显微镜
2、光学系统 （P15图1）
在光学系统中 ，物镜的性能最为关键，分为低、高、油镜头。油 镜的放大倍数最大，在使用时比较特殊，需要在载玻片与镜头之 间加滴镜油——香柏油。 返回
四、油镜的原理：
放大倍数可100倍之大，焦距很短，光强度最大。 油=1.52（香柏油） 介质折射率 水=1.33 空气=1 玻璃=1.55 香柏油对光的折射率与玻璃相似，光线直接通过香柏油进 入物镜而不发生折射，不但增加了照明度，而且使油镜的 数值孔径增加，用NA表示，一般在1.2—1.4。低高倍镜头 等干镜NA都低于1.0。若以可见光的平均波长为0.55μm来 计算，数值孔径通常在0.65的高倍镜只能分辨出距离不小 于 0.4 μm的物体而油镜的分辨率却可达到 0.2 μm左右。可 见显微镜的放大效能是由数值孔径决定的。
实验一显微镜的使用、细菌形态和结构观察与革兰氏染色法
实验一显微镜的使用、细菌形态和结构观察与革兰氏染色法一、显微镜的使用普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。
以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。
普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。
（一）显微镜的构造普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。
1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件（1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。
在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。
（2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。
从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。
因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。
镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。
因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。
国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。
（3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。
Nikon显微镜装有四个物镜。
转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
（4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。
在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。
（5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。
如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。
（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。
新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。
微生物实验报告---普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色郑小煜201100140069生命科学学院生科3班同组者:赵莉、高瑞、刘梦迪2012年10月10日一、实验目的和要求1、学习显微镜的使用方法。
微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌单染色。
2、学习3、初步认识细菌的显微形态特征。
4、学习并掌握细菌革兰氏染色，了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理1、细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对他们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而更能清楚的观察到其形态和结构。
2、油镜:油镜的放大倍数可达100倍，焦距很短，直径很小，但所需的光照度却很大。
为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油(通常用香柏油)。
且油镜分辨率很高，可达0.2微米左右。
3、通常采用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色;当细胞处于碱性条件下所带正电荷增加时，可采用碱性染料染色。
4、革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G?)和革兰氏阴性(G?)两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
实验三 显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色
一、实验目的 了解并掌握油镜的原理和使用方法； 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在 油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。
二、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、葡萄球菌 2、仪器：显微镜 3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol碘 液、95％乙醇、0.5%沙黄染色液 4、材料：载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜 纸
直接用高倍镜或油镜观察？ 4、革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如
何控制这一步？
葡萄球菌
大肠杆菌
（1）涂片：：载玻片要洁净无油迹；滴生理 盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可 过于浓厚
（2）固定： 染色前必须固定细菌，其目的是： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。 二是增加其对染料的亲和力。常用加热固定
法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜， 温度过高会改变甚至破坏细胞形态。
（3）染色（先阅读p.31的注意事项）
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色 是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性 菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被 误染成阴性菌。
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲 洗后，应摔去细胞上的残水，以免染色液 被稀释。
（4）镜检(p.24，用低倍、高倍、油镜 分别观察细菌)
D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰
（二）油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光 线由反光镜通过玻片与镜头 之间的空气时，由于空气与 玻片的密度不同，使光线受 到曲折，发生散射，降低了 视野的照明度。若中间的介 质是一层油（其折射率与玻 片的相近），则几乎不发生 折射，增加了视野的进光量， 从而使物象更加清晰。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过 于密集的细菌，常常呈假阳性。
革兰氏染色法
普通光学显微镜的使用及微生物形态观察与革兰氏染色法付伟伟200900140022 微生物实验北楼314摘要本实验选用金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和大肠杆菌为标本，进行革兰氏染色，并在油镜下观察其生物形态。
实验过程属于无菌操作。
关键词革兰氏染色；油镜；无菌操作引言现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，他直接影响着显微镜的分辨率。
在普通光学显微镜配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要，与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间加滴镜油。
镜油一般选用香柏油。
镜油有两个方面的作用：增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。
革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G—）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先用草酸铵结晶紫初染，所有的细菌都会染上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘和结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了结晶紫在菌体中的滞留能力。
之后用95%酒精作为脱色剂经行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
格兰仕阳性细菌的细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物很容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又染上复染剂颜色（红色）。
本实验之所以采用金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，是因为他们代表了微生物的两种基本形态：球状和杆状细菌，而且枯草芽孢杆菌具有微生物重要的内含物—芽孢，与普通杆菌有所不同。
实验三 革兰氏染色
3. 脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出 的酒精刚好不出现紫色，大约20秒钟，立即用水洗。
4.复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片 用吸水纸吸干或者放空气中晾干。
革兰氏染色流程图
三、涂片观察 (1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。 (2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。 (3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。
注意事项
1.涂片后要注意固定、干燥，以免标本被冲洗掉。 2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。
如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。 如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响， 难以严格界定。
3. 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的 残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
2. 再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片 两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。
3. 将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反 面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然 干燥）。 待涂片冷却后，再加染色液。
涂片制作
二、革兰氏染色
1. 初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色 约1分钟后水洗。
4. 选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄 太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
实验结果
菌名
菌体颜色 菌体形态 G+或G（图示）
金黄色葡萄Leabharlann 菌大肠杆菌土壤分离细菌
谢谢！
实验器材
（一）金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,土壤分离细菌。
微生物实验报告---普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色郑小煜201100140069生命科学学院生科3班同组者:赵莉、高瑞、刘梦迪2012年10月10日一、实验目的和要求1、学习显微镜的使用方法。
微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌单染色。
2、学习3、初步认识细菌的显微形态特征。
4、学习并掌握细菌革兰氏染色，了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理1、细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对他们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而更能清楚的观察到其形态和结构。
2、油镜:油镜的放大倍数可达100倍，焦距很短，直径很小，但所需的光照度却很大。
为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油(通常用香柏油)。
且油镜分辨率很高，可达0.2微米左右。
3、通常采用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色;当细胞处于碱性条件下所带正电荷增加时，可采用碱性染料染色。
4、革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G?)和革兰氏阴性(G?)两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
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实验三-普通光学显微镜的使用方法及细菌的革兰氏染色法实验三普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色、革兰氏染色法生科15.2 周罡201500181104【实验目的】1.复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。
3.掌握利用显微镜观察不同微生物的基本技能，了解球菌、杆菌、放线菌、酵母、真菌在光学显微镜下的基本形态特征。
4.学习并掌握微生物的制片及简单染色的基本要求。
5.学习并掌握革兰氏染色法。
6.了解革兰氏染色原理。
7.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
【实验原理】（一）普通显微镜的基本原理1.基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。
它们包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
2.油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。
由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）图2 介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较（二）简单染色的原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对菌体进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构的方法叫做简单染色。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时尽量维持细胞原有的形态。
（三）革兰氏染色法的原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用Gˉ表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G 和G-两大类群，常用的复染液是番红。
经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
1）G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
2）Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
【实验器材】1.菌种枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，大肠杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，自选菌种两种。
2.溶液和试剂草酸铵结晶紫染液，卢戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番红复染液，无菌水，香柏油，二甲苯3.仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），接种环，滴管【实验步骤】（一）显微镜的使用方法1.观察前的准备（1）显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距试验台边缘约10cm。
镜检时姿势要端正。
（2）光源调节：调节安装在镜座内的光源灯的电压获得适当的照明强度。
（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜2.显微观察（1）低倍镜观察：将要观察的玻片标本置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节至图像清晰。
通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
（2）高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。
对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
（3）油镜观察：在高倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将高倍镜转离工作位置，在待观察的样品区域上滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。
调节照明使视野的亮度合适，微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。
3.显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下载玻片。
（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。
（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
（4）将各部分还原，将光源灯亮度调至最低后关闭，将最低放大倍数物镜转到工作位置，同时将载物台降至最低位置。
（二）细菌制片及简单染色1.涂片取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加一小滴无菌水，用接种环无菌操作分别由枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面和金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面挑取适量菌苔，将沾有菌苔的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可。
2.干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准。
3.染色将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min。
4.水洗倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止。
5.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥，或将载玻片通过火焰2-3次。
6.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
（三）革兰氏染色1.涂片取一块载玻片，在玻片的一面用记号笔做好标记，在标记的一面上边用胶头滴管加几小滴无菌水，分别取5种活跃生长期菌种（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，自选菌（1），自选菌（2））按常规方法涂片（不宜过厚）。
2.干燥与固定涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准。
3.初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1.5min后倾去染液，水洗至流出水无色。
4.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
5.脱色先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗。
6.复染将载玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色1.5~2min，水洗，吸去残水晾干。
7.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。
分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及两种自选菌的染色结果。
【实验结果】。