流式细胞术测定植物基因组大小

临床型(BD,FACSCalibur台式机)
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
大型机(BD,FACSAria科研型)
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和 类型激光器
➢可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样 品作对照，来换算出DNA的绝对含量。
样品2C DNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/ (标准G0/G1峰均值)] ×标准2C DNA含量(pg DNA)
测量DNA的相对含量时，须设一已知倍性的同类材料作照， 换算出待测样品的DNA相对含量，进行倍性分析。
光电转换 数据处理系统 • 细胞分选系统
液流系统：流动室、液流驱动系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
液流中心由单列 匀速运动颗粒组 成的液柱
分选系统
488 nm laser
Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC(前角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小
SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化
Laser
FALS Sensor
G0G1
count
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
DNA检测的常用术语
变异系数(Coefficient of Variation,CV)：通常以G0/G1峰的宽度来反映,该 指标反映了仪器的分辨率或精确度。影响CV的因素主要包括两方面： 仪器因素（如鞘液的流速、光路、机器调试等）和样本制备(如样品中 碎片含量、细胞团块、细胞活性和细胞浓度等)及染色过程对标本的人 为影响。优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变 异。
DNA的倍体和DNA指数的关系
DI=1.0±0.01 DI=1.0±0.15 DI=2.0±0.1
DI>2.10
二倍体 近二倍体 四倍体 多倍体
例：
D N A 倍 体
正 二 倍 体 (2n,D iploid) 亚 二 倍 体 (H aploid) 四 倍 体 (T eraploid) 低 倍 体 (H ypoploid) 高 倍 体 (H yperploid)
ImageStream成像流式细胞仪
分选微型模式生物
COPASTM 生物分选系统
模式动植物研究、大体积细 COPAS在线虫分选方面的应用，就在 胞研究及药物筛选等方面 Nature系列杂志上发表了7篇以上的文献
流式细胞仪的工作原理
• 光学系统 激光光源 光收集系统
• 液流系统 流动室
液流驱动系统 • 电子系统
BD(Becton Dickinson)公司：FACSCalibur、FACSAria、 FACS Vantage Diva等；
BC(Beckman Coulter)公司：EPICS XL/-MCL、 CytomicsTM FC500系列等。
目前流式细胞仪可分为两类：
台式机和大型机
EPICS XL 流式 细胞分析仪
数据显示类型
单参数直方图（Histogram）
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系
Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
二维等高图和密度图
二维点图Dot Plot
➢便于数据统计
➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记
DNA指数(DNA index,DI)：DI指的是样本G0/G1峰的平均道数与正常二
倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1 意味着二倍体(2c)。
DI=
样品G0/1细胞峰均道值
正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值
倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体 细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1 的细胞为 四倍体(CV<5%)。除二倍体和四倍体，其他均称异倍体。
➢适用于高速分选 和多色分析
流式细胞仪检测范围
细胞大小
细 胞 结 构
细胞粒度
细胞表面面积
细
核浆比例
பைடு நூலகம்
胞 功
DNA含量与细胞周期 能
特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
RNA含量 蛋白质含量
激素结合位点 细胞受体
流式细胞技术的最新突破
细胞信号转导/通路分析 细胞间相互作用 分子共定位与胞内分子转运 细胞形态学 荧光原位杂交 基因表达分析 细胞凋亡 细胞周期分析 白细胞亚群分析
流式细胞仪(Flow Cytometer)
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细 胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
高灵敏度
当代最先进的细 胞定量分析技术
无害分析 和分选
国际两大流式细胞仪生产商：
FACSCalibur 流式 细胞分析仪
➢主要表达方式
Pseudo 3D Plot
3D Plot
二 植物C值分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱 基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光， 荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞的DNA含量。
流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
流式细胞术测定植物基因组大小
一 流式细胞术的基本知识
概念
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细 胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分 选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综 合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等 各学科的知识，它是一种自动分析的技术。