引导组织再生膜的开发

各位老师、同学，下午好，，欢迎参加我的毕业答辩。

我的汇报分为以下5个方面，首先是研究背景和立题依据。

肿瘤、感染、外伤、手术等均可导致骨缺损。如果缺损小于临界骨缺损，则其可以自行愈合，而当缺损大于临界值，则需要一定的治疗手段辅助其愈合。自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但是由于供骨量有限，且会对患者造成二次损伤，使其在应用中受到极大制约。随着骨组织工程的发展，骨组织工程支架和引导组织再生膜将逐渐取代传统的治疗方法。

GTR膜覆盖于缺损区域，主要是作为物理屏障阻止生长速度较快的纤维结缔组织长入，为骨组织的生长提供空间，从而使骨生成细胞从邻近的骨缺损边缘或骨髓组织迁移入缺损区域，在无干扰的情况下完成骨再生

以种植体周围骨量不足为例，如果牙槽脊萎缩等情况造成种植体周围骨量不足，直接缝合皮瓣，会造成纤维样修复，导致种植体松动从而失败。如果在缺损处覆盖GTR膜，则可以形成物理屏障，阻止软组织侵入，为骨组织生长提供空间，最终缺损形成新骨。GTR膜可以和骨组织工程支架一起使用，在阻止软组织长入的同时，防止骨粉的外溢。

鉴于GTR膜的使用目的，要求----良好地生物相容性, 合适的支撑强度, 在体内保持一定时间。目前，市场上的GTR膜分为可吸收和非可吸收，每种膜片都有其优缺点。

非可吸收膜以聚四氟乙烯膜为代表，其具有良好的稳定性和生物相容性，机械性能良好，能较好地维持空间形态，且可以根据需要调整其在体内的滞留时间。但是给其不能降解，所以需要二次手术取出。可吸收膜以盖氏公司的胶原膜为代表，其为双层不对称膜片，上层致密可阻止软组织的长入，下层疏松，可为骨组织的生长提供支架。可吸收膜往往降解过快，机械强度较差，易发生塌陷。

所以理想的GTR膜片应当具备良好地生物相容性、适当的降解速度、降解产物无毒性，可阻止上皮细胞的长入，具有一定的机械强度和良好地可操作性

壳聚糖及其衍生物因具有良好地生物相容性、抗菌、可降解等优点，所以广泛应用于医用生物材料领域。本研究欲筛选出一种壳聚糖衍生物，调控其降解速度，探究合适的方法来构建一种组织引导再生膜。

第一部分实验，进行了材料的筛选和膜片的制备

实验中选择了对骨修复有促进作用的四种材料----。首先提取了大鼠骨髓间充质干细胞，用MTT法检测了四种材料在不同浓度下对细胞增殖的影响。结果显示在糖的浓度为200μg/ml 时对细胞的影响最为明显。由图片可知，除了磺酸化壳聚糖对细胞的影响表现出先促进后抑制，其他三种糖均对细胞表现出不同程度的促进作用。所以，最后我们选择了促进作用最为明显的羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素构建膜片。

但是以羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素为原材料构建的膜片机械性能较差,且呈现弱酸性，这可能会导致膜片支撑强度不足，引起炎症反应，所以我们在膜片中添加一定的纳米羟基磷灰石。，羟基磷灰石是天然骨的主要的无机成分，具有极好的生物相容性和骨诱导能力，且呈弱碱性，可以提高膜片机械强度中和膜片中酸性物质。将含有不同比例纳米羟基磷灰石的膜片制出浸提液，通过细胞毒性实验来选择合适的比例。结果显示含有--- 综合膜片的细胞毒性和机械强度，最终选择添加10%纳米羟基磷灰石。

确定了原材料后，进行了膜片的制备工作，过程如下。先将羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素、纳米羟基磷灰石、Nacl、DMSO配制成溶液，流延法铺膜，表面加入DMSO后放入-80度中冷冻，然后用CaCl2和1,4-丁二醇双缩水甘油醚进行交联，交联完成后清洗记得到我们需要的膜片。经测量，膜片的厚度为0.03mm，机械性能良好，左图为膜片的纵截面，上表面较为致密，下表面疏松多孔，下表面的横截面如右图所示，孔径约为50-200μm。

第一部分实验所得出结论如下，

羧甲基壳聚糖和硫酸软骨素可以促进BMSCs的增殖，以羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素和纳米羟基磷灰石为原料，所构建的膜片为双面不对称膜片，膜片具有良好地机械性能

然后，在第二部分实验对膜片的生物安全性和降解性能进行了验证

首先是生物相容性实验，将传至第三代的骨髓间充质干细胞接种到清洗干净的膜片上，培养24h 和48h后，加入FDA荧光染料，荧光显微镜下进行观察。从图中可以看出，细胞可以在膜片上粘附，48h后细胞更为伸展，细胞间相互接触，生长状态良好，说明该膜片具有良好的细胞相容性。

将膜片分别植入大鼠的背部皮下和腿部肌肉，观察组织相容性和生物降解性能。图中所示为实验过程。

在术后1周、2周、4周、8周、12周、16周分别牺牲三只大鼠，观察膜片的降解情况和炎症反应。背部皮下膜片在1周时有毛细血管充血现象，腿部肌肉中的膜片在第1周和第2周呈现黄色，说明有轻微的炎症反应出现。但是随着时间的延长，炎症反应消失。

对不同时间点的膜片质量进行统计，结果显示膜片在肌肉和皮下均经历了先升高后降低的趋势，分析其原因可能是膜片中的羟基磷灰石和钙离子先被吸收，离子型交联丢失，膜片结构松散，吸水后质量升高。但是随着降解的进行，膜片残留质量进一步下降。

取与膜片接触的皮肤和肌肉，进行病理切片，可见在1周和2周时，皮下和肌肉均有炎症细胞浸润，第4周时炎症细胞基本消失，这说明膜片具有良好的组织相容性。

对本章内容进行总结，通过体外细胞实验和体内植入实验，验证了膜片具有良好的生物相容性。将膜片植入大鼠的背部皮下和腿部肌肉，可以观察到膜片至少可在体内保持2个月，符合引导组织再生膜对膜片降解性能的要求。

第三部分实验用大鼠极限颅骨模型验证了膜片的引导组织再生作用。

实验中选择了体重为300到350克的大鼠，麻醉后，头部剃毛，切开皮肤，分离皮下软组织，暴露颅骨，并在在大鼠左侧颅骨钻孔，制作直径为5mm的大鼠颅骨全层缺损。实验组大鼠在缺损处覆盖膜片，然后后依次缝合软组织和皮肤。对照组直接缝合软组织和皮肤。

术后第4周，第8周，第12周每组分别牺牲4只大鼠，取缺损处骨组织，制作病理切片，由上图可知，实验组在第4周有少量新骨生成，第8周有大量新骨生成，第12周基本完成修复，且新骨区域出现了髓状结构。髓状结构中可能存在新生血管和干细胞，对骨修复具有积极作用。对照组直至第8周都没有明显新骨生成，第12周时有少量新骨。

对病例切片进行masson染色实验组骨缺损在第三个月基本完成修复，对照组呈纤维样修复，结果与HE染色相一致。分析原因，一可能是因为膜片具有良好地引导组织再生作用，二可能是膜片降解所释放的钙磷、以及小分子糖类对成骨细胞和间充质干细胞的生长和增殖起到了促进作用。

最后对全篇进行总结

筛选出羧甲基壳聚糖、硫酸软骨素和纳米羟基磷灰石作为构建引导组织再生膜的原材料

构建了双面不对称引导组织再生膜，膜片具有良好的机械性能、良好的生物相容性和降解性，和良好的引导骨组织再生的功能。

本文的创新点在于

首次将DMSO引入膜片构建体系，并通过双交联构建了双面不对称羧甲基壳聚糖/纳米羟基磷灰石膜片

该膜片具有良好地机械性能、生物相容性、生物降解性和引导组织再生功能。

不足之处

未设置现有引导组织再生膜作为对照

膜片覆盖于颅骨缺损处时个别大鼠发生了膜片的移动，应寻找合适的固定方法