不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶
两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）
作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。
合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法
化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED）
实验结果的分析
相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
分 布(%)
清蛋白
6.9
6.1
55
1-球蛋白 2.1~30.8 7.3
5.0
2-球蛋白 4.1~72.5 6.8
9.0
-球蛋白
1.2~25 7.6
13.0
-球蛋白
15.6
8.0
11.0
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED）
聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度
凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100%
a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整））
蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场 的作用下在特定的介质中向与其电荷性 质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异
电荷性质 电荷数量
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 ．掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 ．熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状，在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量，因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同，二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动，经过一定的时间后得以分离，这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关，为了使其只与蛋白质分子的大小有关，从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量，就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质），使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? ，即 1.8 nm ），而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
说明， SDS 和蛋白质的结合所形成的 SDS- 蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质形状不同而对电泳迁移率的影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要 充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形 瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米 左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性 完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内， 再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即 可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
03
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨率和分离范围广的优点，广泛应用于蛋 白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
03
实验材料与设备
实验材料
01
02
03
04
05
血清样品
丙烯酰胺和N,N'- 分离胶和浓缩胶 甲…
电泳缓冲液
Байду номын сангаас
染色液和脱色液
用于电泳分离的血清样品 ，应保证新鲜、无菌，且 无杂质。
用于制备凝胶的原材料， 应保证纯度高、无杂质。
电泳仪
用于电泳分离的设备，应保证 性能稳定、精度高。
电源
用于提供电泳仪所需的电流和 电压，应保证安全、稳定。
电子天平
用于称量实验材料，应保证精 度高、稳定性好。
04
实验步骤与操作
实验前的准备
准备试剂
准备凝胶板
确保所有试剂都已正确配制，包括丙烯酰 胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、 Tris-HCl、甘氨酸、过硫酸铵等。
用于电泳分离的不同浓度 的凝胶，应保证性能稳定 、无杂质。
用于维持电泳过程中的pH 值和离子强度，应保证质 量稳定、无杂质。
用于染色和脱色分离后的 凝胶，应保证无毒、无害 、无污染。
实验设备
垂直电泳槽
用于放置凝胶和电泳缓冲液的 容器，应保证密封性好、不易 变形。
离心机
用于制备血清样品，应保证性 能稳定、易于操作。
结合其他技术
结合质谱分析、免疫印迹等其他技术，对分离出的蛋白质进行定性和 定量分析，以更深入地了解蛋白质的性质和功能。
应用于临床研究
进一步研究血清中特定蛋白质与疾病之间的关系，探索其在临床诊断 和疾病监测中的应用价值。
生物化学实验-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
实验原理
电泳：是带电颗粒在电场作用下，作定向运动即 向着与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据 各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷 多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。 区带电泳是样品物质在一惰性支持物上上进行电 泳的过程。因电泳后，样品不同组分形成带状区 间，故称区带电泳。
在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的SDS时，蛋白质分子 的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其他因素对电泳 迁移率的影响几乎可以忽略不计。当蛋白质的分子量在 15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关 系，符合下列方程式：
lg MW=-b·mR+K MW为蛋白质分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，k为截 距。在条件一定时，b和K均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图， 可获得一条标准曲线。未知蛋白质的相同条件下进行电泳，根 据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
实验步骤
凝胶的制备 蛋白质样品的处理 加样：用微量注射器依次在各个样品槽内加样，各加
10～15μl（含蛋白质10～15μg），稀溶液可加20～30μl
电泳凝胶配方：
30.8%Acr-Bis
1.5mol/l Tris(pH8.9)
0.5mol/l Tris(pH6.7) ddH2O水
10%SDS
10%过硫酸铵AP
3、样品处理与加样 ⑴样品制备
取蔗糖酶样品（样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）各50μl，分别放入1.5ml离心管中， 12000r/min离心10分钟，上清即为电泳样品。 ⑵样品处理
将离心后的上清各取20ul，加入等体积“2×蛋白质样品溶解液”，100℃保温 3分钟，取出冷却后，12000r/min离心2min,取上清直接加样。 ⑶加样
生化实验七 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
实验七 SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量一、 实验原理了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量 二、实验原理带电的颗粒(蛋白质)在电场的作用下，移动的速度是根据此公式，在同一电场强度(v ／d)和电极缓冲液(η)条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电量(q)和自身分子的大小(6πr)。
若使各蛋白质成分的带电量(q)相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小(6πr)。
1967年Shapiro 等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate ，SDS)，不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。
加入SDS 之所以能获得如此的效应，是因为SDS 能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。
同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的SDS 相结合[溶液中的SDS 总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS 按1:1.4(W ／W)的比例结合]，形成SDS 一蛋白质复合物。
其结果： (1)由于SDS 解离后带有很强的负电荷，致使SDS 一蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。
(2)SDS 与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。
不同SDS 一蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。
这样SDS 一蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。
需要注意的是：为使SDS 与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。
因此，在用SDS 处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
一、实验目的 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 2．了解该电泳的特点及适用范围。 ．了解该电泳的胺凝胶电泳的三种效应： 讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： 1、浓缩效应。 1、浓缩效应。 2、电荷效应。 、电荷效应。 3、分子筛效应。 、分子筛效应。
实验思考
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 2、由本次实验结果解释醋纤薄膜电泳分离后 、 各条区带清晰度的差别。 各条区带清晰度的差别。
四、实验材料
1．圆盘电泳槽。 ．圆盘电泳槽。 2．电泳仪。 ．电泳仪。 3．玻璃管（10×0.6 cm）。 ．玻璃管（ × ）。 4．50l微量注射器、5ml注射器。 微量注射器、 注射器。 ． 微量注射器 注射器 5．10 cm长的局麻针头，10号针头。 长的局麻针头， 号针头 号针头。 ． 长的局麻针头 6．试剂 ．
三、实验原理
本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电 荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效 电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。 应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好， 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成5～ 个组分 个组分， 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成 ～7个组分， 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12～ 个 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出 ～30个 组分。 组分
五、实验方法
（一）凝胶柱的制备 1．凝胶玻璃管的准备 ． 2．分离胶的制备 ． 3．浓缩胶的制备 ． 4. 装柱
(二)加样 二 加样 (三)电泳 三 电泳 (四)剥胶 四 剥胶 (五)固定和染色 五 固定和染色 (六)漂洗 六 漂洗
聚丙烯酰胺凝胶电泳(共42张PPT)全
配制20ml不同浓度分离胶 所需各种试剂用量/ml
5% 7.5% 10% 15%
配制10ml浓缩 胶 所需试剂用量
3%
3.33 5.00 6.66 10.00
-
2.50 2.50 2.50 2.50
-
-
-
-
-
3.0
-
-
-
-
1.25
0.20 0.20 0.20 0.20
0.10
1%TEMED 重蒸馏水
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
概述
❖1967年由Shapiro建立。
❖1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入 离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移 率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽 视。
基本原理
1.蛋白质分子的解聚
(1)SDS
（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)
阴离子去污剂 变性剂
助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构
❖ (2)强还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的 谱带即为蛋白质亚基。
实验原理
浓缩效应：不连续性所致 制胶缓冲液：Tris-HCl （根据亚基分子量分离蛋白质） (3)二硫键是否完全被还原 与蛋白质的结合量：大多数1. (2)样品缓冲液的离子强度 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 圆盘电泳 不连续SDS-PAGE 1967年由Shapiro建立。 注入电极缓冲液 用 (3)二硫键是否完全被还原 选择适当的凝胶浓度。 （根据亚基分子量分离蛋白质） ＞100 糊状不成形，易破碎。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
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2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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33
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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44
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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45
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
§4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳
常用的硅化剂为二氯二甲基硅烷 （dichlorodimethyl silane）,商品名为Siliconisel25。为了灌胶时不漏胶，可在封边条和玻璃板之 间涂医用凡士林，也有人用冷却至50℃的1%琼 脂糖凝胶封堵缝隙。或用胶带纸或医用橡皮膏将 玻璃板的三个边缘封贴。 三、制胶 根据所需的凝胶浓度配制凝胶溶液，参见表 4.7，灌胶前加入TEMED。
§4. 3. 2 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（continuous electrophoresis）是1959年L.Weintraub和 S.Raymond最早创立的，是指电泳系统采用相同孔 径的凝胶和相同的缓冲液（包括样品缓冲液、凝胶 缓冲液和电极缓冲液），在pH恒定、离子强度不 同的条件下进行区带电泳。
C = 6.5－0.3T
（4.14）
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C 值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围 约为 ±1％。
当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加 而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最 小。C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大 于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的 C是2.6％和3％。
该技术是利用样品（如蛋白质）的电荷效 应进行分离的，而凝胶的分子筛效应不明显。 一般只用于分离简单的样品，分辨率不高。 但由于其具有制胶简便、快捷、缓冲系统组 成简单、 pH 恒定等优点，至今还有部分实 验在使用该方法。
§4. 3. 3 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（discontinuous electrophoresis，也称为圆盘电泳）是20世纪60 年代中期由S.Hjertè n、L.Orenstein和B. J. Davis 创建并完善的电泳技术。是指使用不同孔径的 凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳过程 中，凝胶按需要在一块玻璃板内被制成不同浓 度的两部分（小的部分是浓缩胶，大的部分是 分离胶）。
(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析
常见问题及分析1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。
由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因如下：
1. 聚丙烯酰胺凝胶具有均一的孔隙结构，能够将待分离的DNA、RNA或蛋白质分子按大小分离。
这种凝胶的孔隙大小和形状可以通过调整聚合物交联程度、孔隙添加剂以及电场强度等方式进行调节，从而实现高精度和高分辨率的分离。
2. 不连续的凝胶结构可以避免样品分子在运动过程中的扩散和混合，从而使分离更为准确和精确。
与连续凝胶电泳相比，不连续凝胶电泳可以获得更高的分离效率，特别是在分离小分子或高度相似的分子时。
3. 不连续凝胶电泳具有更高的网络稳定性和耐久性，可以长期稳定地运行，从而确保分离结果的重复性和可靠性。
此外，不连续凝胶电泳还可以进行多重分离，即将同一个横向凝胶纵向切成若干块，每块分别进行不同物质的电泳分离，这样一次实验就可以达到多种物质的分离效果。
因此，不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高，可以用于高精度和高分辨率的DNA、RNA或蛋白质分离，是分子生物学、生物化学和医学等领域的重要实验技术。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western
• 4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲 线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却 不好，导致分子有不同的迁移率所致 • 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲 线形），由于电泳槽的装臵不合适，尤其是凝胶 和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔 片得凝胶聚和不完全 • 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果 凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。 APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄 色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多， 此时胶太硬易裂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝 （2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上 述固定液250ml，过滤后备用 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容 至1000ml
二
抗
1. 同 上 铺 好 保 鲜 膜 ， 加 1 ： 1000 的 二 抗 1000ul （ 1ul mouse 抗 人 IgG-HRP+ 999ul 抗体稀释液） 2. 同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生 气泡 3. 盖上平皿，同上RT孵育2 hours 4. TBST 10min ×2 ； TBS 10min×1
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因
不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高的原因聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的生物分子分离技术，其分辨率高是因为其不连续性。
本文将从聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、不连续性及其对分辨率的影响等方面进行探讨。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种基于电荷、大小和形状的分子分离技术。
其原理是将待分离的生物分子通过电泳的方式在聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。
聚丙烯酰胺凝胶是一种由聚丙烯酰胺单体聚合而成的三维网络结构，其孔径大小可以通过改变单体浓度和交联剂浓度来调节。
在电泳过程中，待分离的生物分子会在电场作用下向电极移动，移动速度与其电荷、大小和形状有关。
由于聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小不同，不同大小的生物分子会在凝胶中受到不同程度的阻碍，从而实现了分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续性是指凝胶中存在不同孔径大小的孔道，这些孔道之间是不连续的。
这种不连续性是由于聚丙烯酰胺凝胶的制备过程中，单体聚合和交联剂交联的不均匀性所导致的。
这种不连续性使得聚丙烯酰胺凝胶中存在不同大小的孔道，从而实现了对不同大小的生物分子的分离。
三、不连续性对分辨率的影响聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续性对分辨率有着重要的影响。
由于凝胶中存在不同大小的孔道，不同大小的生物分子会在凝胶中受到不同程度的阻碍，从而实现了分离。
这种分离效果可以通过改变凝胶孔径大小来调节。
当凝胶孔径大小与待分离的生物分子大小相当时，分离效果最佳，分辨率最高。
因此，聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续性是实现高分辨率分离的关键因素之一。
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种广泛应用于生物分子分离和分析的技术。
其应用范围包括但不限于以下几个方面：1. 蛋白质分离和鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于分离和鉴定蛋白质，从而实现对蛋白质的定量和定性分析。
2. DNA分离和鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于分离和鉴定DNA，从而实现对DNA的定量和定性分析。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三种效应
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳三种效应1 什么是不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳？不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常见的蛋白质电泳技术，通过将蛋白质样品加入到凝胶中，然后通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移并被分离。
与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳不同的是，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有几个明显的特点，即凝胶有两个分离区域，并且凝胶中的聚丙烯酰胺浓度梯度是不连续的。
2 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳存在着三种效应，分别为“聚集效应”、“前移量效应”和“带电荷效应”。
2.1 聚集效应聚集效应是不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的独特现象之一。
由于凝胶中的聚丙烯酰胺浓度在两个分离区域是不同的，因此在蛋白质样品通过凝胶时，会发生一种聚集现象，使相对较小的蛋白质在凝胶中聚集成高峰。
这种现象在较长时间运行的不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中尤为明显。
2.2 前移量效应前移量效应是由于磷酸盐在凝胶中存在的影响导致的。
磷酸盐在凝胶中的存在可以影响电泳的运行速度，从而导致前移量效应的出现。
这意味着相对较大的蛋白质会有可能向前移动，而相对较小的蛋白质会落后。
可以通过减少样品的负载量和调整样品pH值的方法来减轻前移量效应的影响。
2.3 带电荷效应带电荷效应是由于不连续聚丙烯酰胺凝胶的化学性质造成的。
不同于其他凝胶材料，不连续聚丙烯酰胺凝胶带有大量阴离子的化学官能团，这可以对相对较大的蛋白质产生更明显的阻滞效应。
带电荷效应的存在可以通过凝胶电泳缓冲液中加入含有相同的正离子的药物来降低。
3 结论不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种有着独特性质的分离技术，聚集效应、前移量效应和带电荷效应是这种技术的重要特征。
在使用这种技术时，需要注意这些效应的影响，并尽可能地减小其影响。
不同于传统聚丙烯酰胺凝胶电泳，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质分离中具有更好的分辨率，对于分离复杂的样品有较大的优势。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。
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封正丁醇3mm（观察界面，判断凝固时间）
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、不漏 水、除气泡）
注意事项：
1、倒掉正丁醇，用滤纸吸干再灌浓缩胶。
2、配胶后立即灌胶（用滴管）
3、灌胶后立即清洗滴管，防止胶凝固于 管中。
4、撕掉封口膜，用胶塞将玻璃管固定于 电泳槽上（竖直，防漏）
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶
； (3)对pH和温度变化较稳定； (4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样
品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通
封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时 间掌握25min）
注意事项：
1、封管要严，防止漏液。
2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。
3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准 确加量。
4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立 即清洗）
5、正丁醇沿管壁缓缓加入
浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为8ml， 灌胶高度为1.5cm,留1cm空隙加样）
过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； (7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷
效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的 分辨率。
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
104 1-4×104 1-5×104-1×105
SDS-PAGE
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及 分子的大小 和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁 移率就取决于分子的大 小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967 年，Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。 当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇，巯基乙 醇可使蛋白质分子 中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合 物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可 引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒， 不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白 质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原来的电荷和形状的 影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测 定蛋白质的分子量。
三、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质的原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电 泳的三个不连续
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三 个效应
凝胶孔径 缓冲液pH 缓冲液离子成分 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
3%胶
Gly - Pro - Cl-
Gly Pro Cl-
Gly Pro Cl-
Gly -
Pro Cl-
5、加电极缓冲液（注意液面）
加buffer 样品处理并加样（20ul） 电泳（6mA/管，距底1cm时停止） 剥胶
固定（时间5min） 染色（时间2min） 漂洗脱色至背景透亮
二、电泳基本原理及相关知识
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在 电场的作用下在特定的介质中向与其电 荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。
中山医学院 生物化学与分子生Hale Waihona Puke 学教研室生化与分子生物学技术
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为 10ml，灌胶高度为7~8cm）
纸电泳
醋酸纤维膜电泳 凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 是 由 单 体 丙 烯 酰 胺 (acrylamide ， 简 称 Acr) 和 交 联 剂 N,N- 甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 (N ， N—methylenebisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二 胺 (N ， N ， N ， N—tetramethyl ethylenedia mine ， 简 称 TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8 ，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的 作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物 的 电 泳 称 为 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 (polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
Gly -
Pro Cl-
pH为8.9的电泳缓冲液 （Tris-Gly）
pH为6.7的浓缩胶
6%胶
pH为8.3的分离胶
有效泳动率：
MCl->
M
Pro
>
M
Gly
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓 缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的 Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲 液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成 了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品 浓缩的主要因素。
1×105 5×105 核酸(RNA) 104 104–105 105-2×106
适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
15–20 5-10 2-2.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系 统两大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如 图2)，两者电泳原理完全相同。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异 电荷性质 电荷数量
分子差异 分子大小 分子形状
电泳分离蛋白质的原理
蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异
实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）