第七章 抗体的标记
生物素标记抗体的原理应用
生物素标记抗体的原理应用引言生物素标记抗体是一种常用于生物学实验和生物化学研究的工具。
它可以通过结合生物素和抗体来标记目标蛋白，从而实现对目标蛋白的检测和定位。
本文将介绍生物素标记抗体的原理和常见的应用。
生物素标记抗体的原理生物素标记抗体是通过将生物素分子与抗体共价结合来实现标记的。
生物素是一种天然存在于生物体中的小分子，其与生物素受体（如亲和素或亲和力很强的亲和素结合蛋白）之间具有高度的亲和力。
生物素标记抗体的原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力，通过标记抗体即可实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体的应用生物素标记抗体在生物学实验和生物化学研究中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用：1.免疫组化生物素标记抗体可以用于免疫组化实验中的抗原检测和定位。
通过将生物素标记的抗体与目标抗原结合，再将其与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对抗原的检测和可视化。
2.流式细胞术生物素标记抗体可以在流式细胞术中用于细胞表面标记。
通过将生物素标记的抗体与目标细胞结合，再与荧光素-生物素-蛋白（如荧光素结合蛋白）复合物结合，可以实现对目标细胞的检测和定位。
3.免疫沉淀生物素标记抗体在免疫沉淀实验中广泛应用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与琼脂糖颗粒（如琼脂糖颗粒A/G）结合，可以实现对目标蛋白的沉淀和富集。
4.西方印迹生物素标记抗体在西方印迹实验中也起着重要的作用。
通过将生物素标记的抗体与目标蛋白结合，再与亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物结合，可以实现对目标蛋白的检测和定量。
结论生物素标记抗体是一种常用的生物学实验和生物化学研究工具，其原理基于生物素与生物素受体之间的高亲和力。
通过将生物素标记抗体与目标蛋白结合，可以实现对目标蛋白的检测和定位。
生物素标记抗体在免疫组化、流式细胞术、免疫沉淀和西方印迹等实验中有着广泛的应用。
在将来的研究中，生物素标记抗体将继续发挥重要的作用，并为研究人员提供更多的实验选择和研究手段。
《抗体标记》PPT课件
酶标记技术
❖ 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶 标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色 的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有 色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查， 也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存 在，从而证明了发生了相应的免疫反应
❖ 在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体 金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物
❖ pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗 粒的负电荷相互排斥而不能互相结合
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❖ 透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质 ❖ 去除蛋白质中的沉淀：离心 ❖ 标记：用K2CO3或HCl调节金溶液至所需pH
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❖ 氯胺T法：
原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯 酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子， 使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少 量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射 性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成 带有放射性的化合物
优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得
第十五讲 抗体的标记
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1
抗体的纯化原理、方法
❖ 抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏 水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进 行分离、纯化
❖ 根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法 ❖ 标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化
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抗体的预处理
❖ 过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒 ❖ 低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血
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免疫组织化学常用抗体标记谱系和标志
结蛋白Desmin
Desmin为肌细胞的中间丝蛋白， 正常分布于平滑肌细胞、心肌细胞、 骨骼肌细胞和肌上皮细胞。
上述细胞来源的良恶性肿瘤 desmin阳性反应。主要用于子宫、皮 肤和胃肠道平滑肌肿瘤，横纹肌肿瘤 和肌上皮肿瘤的诊断和鉴别诊断。
肌动蛋白（广谱）Actin
MSA是一种具有收缩能力的微丝 蛋白，广泛分布于几乎所有的肌型为52.5KD，主要标记 非鳞状上皮，因此主要用于腺癌和导 管癌的诊断，鳞癌一般不表达CK8。 有报道肝细胞癌主要表达CK8和CK18。
细胞角蛋白10 CK10
CK10 分 子 量 为 56.5KD 。 主 要 标 记上皮的基底上层和颗粒细胞层，同 时CK10表达与细胞的分化程度呈正 比，高分化者常阳性，主要用于鳞癌 的诊断。
TG是甲状腺滤泡上皮细胞合成 的一种糖蛋白，对甲状腺滤泡上皮细 胞和甲状腺上皮性肿瘤具有较高特异 性，常用于各种甲状腺癌和转移性腺 癌的诊断与鉴别诊断。
肝细胞抗原HPC
HPC是肝细胞较特异标记物，阳 性颗粒定位于肝细胞浆。主要标记肝 细胞及肝细胞发生和良恶性肿瘤、非 肝细胞无交叉反应。
HCG-β
广谱细胞角蛋白PCK
PCK标记所有单层上皮、复层 上皮、移行上皮细胞，各种上皮细胞 来源的良恶性肿瘤、滑膜瘤和间皮瘤 等少部分间叶源性肿瘤亦可阳性。
高分子角蛋白HCK
HCK主要标记复层鳞状上皮及鳞 状 细 胞 癌 ， HCK （ 34βE12 ） 常 用 于 标记前列腺基底细胞，观察基底细胞 存在与否有助于前列腺癌的诊断。
对上皮源性肿瘤，尤其是低分化 腺癌，最好与细胞角蛋白联合应用， 可提高阳性率。
上 皮 特 异 性 抗 原 Epithelial Specific Antigen，ESA，
细胞生物学教案(完整版)
细胞生物学教案〔来自〕目录前言第一章绪论第二章细胞结构概观第三章研究方法第四章细胞膜第五章物质运输与信号传递第六章基质与内膜第七章线粒体与叶绿体第八章核与染色体第九章核糖体第十章细胞骨架第十一章细胞增殖及调控第十二章细胞分化第十三章细胞衰老与凋亡前言依照高等师范院校生物学教学方案，我们开设细胞生物学。
一、学科本身的重要性要最终说明生命现象，必须在细胞水平上。
细胞是生命有机体最根本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上说明各种生命现象。
世界著名生物学家Wilson〔德国人〕曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找〞。
二、学科开展特点细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。
它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学开展的前沿，又是生命科学赖以开展的根底。
三、欲到达的目的通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构开展的需求，也是为考研做打算。
本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。
参考资料1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年〔第四版〕；1980年〔第七版〕《细胞和分子生物学》2 Avers，“Molecular Cell Biology〞， 1986年3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell〞，1989年4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年〔第一版〕；1990年〔第二版〕“Molecular Cell Biology〞5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社7 翟中和，细胞生物学根底，1987年，X大学出版社8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；202X年由科学出版社再版9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，X师范大学出版社10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，202X年再版11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》，12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起〔1—3卷〕，北师大出版社13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社15徐承水，《细胞超微结构研究》202X，中国国际教育出版社学术期刊、杂志国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol.国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等第一章绪论教学目的 1 掌握本学科的研究对象及内容；2 了解本学科的来龙去脉〔开展史及开展前景〕；3 掌握与本学科有关的重大事件和名词。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术第一节抗体的I125标记法基本原理有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。
当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。
蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。
在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。
该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。
试剂及仪器●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1)●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液●凝胶过滤柱●γ-记数器●100g/L 三氯醋酸●70% 乙醇●玻璃纤维滤●氯胺T (Chloramine T)反应用* 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）；* 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。
操作步骤*注意：125I 对健康有害，需要保护措施。
在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。
（一）氯胺T法1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；2．加500 μCi 的Na125I ，混匀；3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀；4．在室温下培养1分钟；5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）；6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。
免疫组织化学常用抗体标记谱系和标志
肌调节蛋白MyoD1
MyoD1是横纹肌肿瘤的一种标记。 主要用于横纹肌肉瘤的诊断，阳性颗 粒位于细胞核。少数非肌源性组织包 括腺上皮、神经母细胞瘤、尤文氏肉 瘤、腺胞状软组织肉瘤可见胞浆阳性。
免疫组织化学 常用抗体标记谱系
第一节 上皮细胞标志
PCK
CK8
EMA
HPC
细胞角蛋白Cytokeratin(CK)
CK 是 一 种 中 间 丝 蛋 白 ， 是 上 皮 细 胞及其肿瘤较特异标志物。CK分子量 为40～60KD，根据其分子量不同分为 20 余 种 ， 并 粗 略 划 分 为 高 分 子 CK （HCK）和低分子CK（LCK）。
Nestin
Nestin是一种新的中间丝蛋白，在 神经上皮干细胞中极为丰富，在原始 神 经 外 胚 层 肿 瘤 (PNET) ， 星 形 胶 质 细胞瘤常呈阳性反应，故在这些肿瘤 的诊断及研究中具有重要意义。
S-100 Protein
S-100是一种可溶性酸性蛋白。有3 种亚型，即S-100a、S-100r、S-100β。 S-100 主 要 存 在 神 经 组 织 、 垂 体 、 颈 动脉体、肾上腺髓质、唾液腺、少数 间叶组织。
广谱细胞角蛋白PCK
PCK 标 记 所 有 单 层 上 皮 、 复 层 上皮、移行上皮细胞，各种上皮细胞 来源的良恶性肿瘤、滑膜瘤和间皮瘤 等少部分间叶源性肿瘤亦可阳性。
高分子角蛋白HCK
HCK主要标记复层鳞状上皮及鳞 状 细 胞 癌 ， HCK （ 34βE12 ） 常 用 于 标记前列腺基底细胞，观察基底细胞 存在与否有助于前列腺癌的诊断。
组织抗体标记过程
组织抗体标记过程嘿，咱今儿就来聊聊这组织抗体标记过程。
这可不是个简单事儿啊，就好像给组织贴上一个个特别的标签，让它们能在显微镜下闪闪发光，被咱清楚地认出来。
你想啊，组织就像是一个大部队，里面有各种各样的细胞在忙碌着。
而抗体呢，就像是一个个带着任务的小特工，专门去找到它们要标记的目标。
这过程可不比警察抓小偷容易哦！首先得准备好一切，就像战士出征前要检查装备一样。
得有合适的抗体，这抗体可不能随随便便选，得是能精准找到目标的那种。
然后就是处理组织啦，要让组织乖乖地躺在那里，等着抗体来标记。
接下来，抗体就闪亮登场啦！它们像是一群有目标的小蜜蜂，嗡嗡地飞向组织。
然后，就像钥匙插进锁孔一样，准确地和目标结合在一起。
这时候，你就得睁大眼睛看着，可别错过了什么精彩的瞬间。
标记好了之后呢？那当然是要观察啦！把组织放在显微镜下，哇，你就能看到那些被标记的细胞啦，就像是夜空中闪闪发光的星星。
这感觉，就像是你发现了一个宝藏一样，让人兴奋不已。
说真的，这组织抗体标记过程就像是一场奇妙的冒险。
每一步都得小心翼翼，不能有丝毫差错。
不然，就像走迷宫走错了路一样，得重新再来。
想象一下，如果抗体标记错了目标，那可就乱套啦！就好像本来要找张三，结果把李四给标记了，那可怎么行呢！所以啊，每一个环节都得认真对待。
在这个过程中，耐心也是超级重要的。
不能着急，得一步一步慢慢来。
就像盖房子一样，得一块砖一块砖地垒起来。
要是着急了，说不定就会弄出个豆腐渣工程。
而且啊，这还需要经验呢！有经验的人就像是老司机，开起车来稳稳当当。
他们知道什么时候该怎么做，遇到问题也能轻松解决。
总之呢，组织抗体标记过程是个既有趣又有挑战的事情。
它就像是一个神秘的魔法，能让我们看到组织里那些隐藏的秘密。
咱可得好好对待它，让它为我们的科学研究发挥出最大的作用呀！这就是我对组织抗体标记过程的理解，你觉得呢？是不是也觉得挺有意思的呀！。
荧光标记抗体
F/P=
2.87×OD495nm OD280nm－0.35×OD495nm
注意事项
1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白 的量等，需注意控制。 2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适 当以避免气泡产生。 3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气 泡、裂隙。 4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。“前切”指柱 顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品；“后切”指样品走至 与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
常用于标记的荧光素： 异硫氰酸荧光黄（FITC） ） 四乙基罗丹明（RB200） ）
（2）标记抗体的纯化
①透析法 ②层析分离法
（3）荧光抗体的鉴定
F/P比率： F/P 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0 A ≈1.0，分 别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记 A 荧光素的特异吸收峰。
F/P值 F/P
实验步骤
收集：当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全 部黄绿色荧光溶液。 黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直 至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝 胶瓶内。
实验步骤
将试管内收集的溶液混匀，作10倍稀释 （0.8ml+7.2ml PB）后在紫外分光光度计分别测 OD495nm和OD280nm值。 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
用Sephadex G-50装25cm层析柱，凝胶沉积约18cm （离管口7 cm，避免凝胶柱干掉），用pH7.0， 0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱约10分钟，流速 控制为1ml/分钟。 吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。 用pH7.0，0.005M PB洗脱，流速控制为1ml/分钟。 可看到黄色与黄绿色荧光在凝胶柱分开。
细胞生物学教案(完整版)
细胞生物学教案（来自）目录前言第一章绪论第二章细胞结构概观第三章研究方法第四章细胞膜第五章物质运输与信号传递第六章基质与内膜第七章线粒体与叶绿体第八章核与染色体第九章核糖体第十章细胞骨架第十一章细胞增殖及调控第十二章细胞分化第十三章细胞衰老与凋亡前言依照高等师范院校生物学教学计划，我们开设细胞生物学。
一、学科本身的重要性要最终阐明生命现象，必须在细胞水平上。
细胞是生命有机体最基本的结构和功能单位，生命寓于细胞之中，只有把各种生命活动同细胞结构相联系，才能在细胞水平上阐明各种生命现象。
世界著名生物学家Wilson（德国人）曾说过：“一切生物学问题的答案最终要到细胞中去寻找”。
二、学科发展特点细胞生物学涉及知识面广、内容浩繁且更新迅速。
它同生物化学、遗传学形成生命科学的鼎立三足，既是当代生命科学发展的前沿，又是生命科学赖以发展的基础。
三、欲达到的目的通过系统地学习细胞生物学，丰富细胞学知识，以适应当代人类社会知识结构发展的需求，也是为考研做准备。
本课程讲授51学时，实验21学时，共72学时。
参考资料1 De.Robertis，《细胞生物学》，1965年（第四版）；1980年（第七版）《细胞和分子生物学》2 Avers，“Molecular Cell Biology”， 1986年3 Alberts，《细胞的分子生物学》，“Molecular biology of the cell”，1989年4 Darnell，《分子细胞生物学》，1986年（第一版）；1990年（第二版）“Molecular Cell Biology”5郑国錩，细胞生物学，1980年，高教出版社；1992年，再版6 郝水，细胞生物学教程，1983年，高教出版社7 翟中和，细胞生物学基础，1987年，北京大学出版社8 韩贻仁，分子细胞生物学，1988年，高等教育出版社；2000年由科学出版社再版9 汪堃仁等，细胞生物学，1990年，北京师范大学出版社10 翟中和，细胞生物学，1995年，高等教育出版社，2000年再版11 郑国錩、翟中和主编《细胞生物学进展》，12翟中和主编《细胞生物学动态》，从1997年起（1—3卷），北师大出版社13徐承水等，《分子细胞生物学手册》1992，中国农业大学出版社14徐承水等，《现代细胞生物学技术》1995，中国海洋大学出版社15徐承水，《细胞超微结构研究》2000，中国国际教育出版社学术期刊、杂志国外：Cell、Science、Nature、J.Cell Biol.、J.Mol. Biol.国内：中国科学、科学通报、实验生物学报、细胞生物学杂志等第一章绪论教学目的 1 掌握本学科的研究对象及内容；2 了解本学科的来龙去脉（发展史及发展前景）；3 掌握与本学科有关的重大事件和名词。
抗体的标记——精选推荐
抗体的标记在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。
依据实验目的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。
一、抗体的标记的直接法与间接法（一）直接法直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原）结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量测量的方法。
（二）间接法间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗）与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。
此方法带有比直接法更多的标记物，因此较直接法灵敏。
二、标记物的选择无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。
表1-2-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。
表1-2--1 标记物的选择标记物检测方法优点缺点应用生物素与各种标记物偶联的亲和素与链霉亲和素保存时间长，灵敏度高，检测手段多样步骤过多，存在内源性生物素干扰，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹荧光色素荧光显微镜或荧光计保存时间长，分辨率高自发荧光，易淬灭免疫组化酶底物显色保存时间长，灵敏度高，肉眼直接可见，检测手段多样步骤过多，存在内源性酶的干扰，分辨率低，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹125I或131Iγ计数仪、放射自显影易于直接标记，灵敏度高半衰期短，对人体有害免疫印迹、定性定量免疫分析生物合成放射自显影、β计数仪不损伤抗体、操作简便半衰期短，敏感性低，需杂交瘤细胞免疫印迹、定性定量免疫分析胶体金显微镜、电镜、肉眼特异性强、灵敏度高、应用范围广、可用于双重和多重标记对试剂、玻璃器皿内的要求极高，标记物浓度较高免疫组化、流式细胞术、定性定量免疫分析第二节免疫组织（细胞）染色技术一、基本概念免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
第七章 抗体的标记
第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备
第一节
标记物的种类及特性
重点提示
放射性核素
荧光物质
酶和酶作用底物
化学发光剂
量子点 胶体金
第一节 标记物的种类及特性
标记免疫技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪标记物
高特异性 精密仪器检测
既可以与抗原或抗体相结合，
又可以被相应的仪器所检测 的物质，这就是标记物
胶体金制备原理
胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，聚合
成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。 常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷 、硼氢化钠等。 根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备 0.8nm～150nm不等的胶体金颗粒。
胶体金制备方法
常用的方法为柠檬酸三钠还原法
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA）
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计测 量。
四、化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形
式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。
直接化学发光剂
酶促反应发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作
用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特 有基团，可直接标记抗原或抗体。
第七章免疫组织化学技术【实用资料】
（immunofluorescence cytochemistry）
免疫组化
原位杂交技术
膀胱癌和癌旁组织上用ADAM12 T3 反义探针检测到阳性杂交信号(C,D)， 而正义探针在癌旁的正常组织中只见 到很弱或阴性信号(E,F)。D和F分别是 C和D的黑视野图像。
定量免疫 组化技术
免疫组织化学技术基本流程
（protein A immunocytochemistry） （7）生物素-亲合素系统介导的免疫组织化学方法
（biotin-avidin system cytochemistry）
3．按应用方式不同分类
（1）免疫电镜组化技术 （immunoelectromicroscopy cytochemistry）
固定剂选择
• 血涂片：丙酮，福尔马林（胞质蛋白，BCR） • 细胞涂片：95%乙醇、carbowax. • 冰冻切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛 • 石蜡切片：福尔马林（需抗原修复）、氯化汞（胞浆蛋白）
PLP/PLDP（糖类、脂类）、乙醇、丙酮
固定方法
• 浸泡法 • 蒸汽法 • 注射、灌注法 • 微波固定
• 注意事项： • 自然冷却、避免蒸干、条件统一，结构改
变，适当加入螯合剂
免疫组织化学技术基本流程
一、样品的制备 二、抗原抗体反应 三、化学呈色反应 四、免疫组织化学结果及其分析
染色策略
ABC PROCEDURE UTILIZING CATALYZED SIGNAL AMPLIFICATION (CSA)
组织细胞的固定
（Fixation）
➢ 要求：
➢ 完整性、天然性、抗原性、便于后期操作
➢ 策略：
➢ 快速脱水、阻断酶活、保持抗原性
标记抗体技术
免疫酶相关的免疫制备技术
用于标记的酶
❖ 辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase, HRP ）
沉淀溶解透析
取出分装
SDS－PAGE检测
❖ 实验结果
提纯的兔抗鸭IgG的SDS-PAGE
M：蛋白Marker 1：提纯的兔抗鸭IgG 2:兔血清
❖ 凝胶过滤层析
主要是根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白 质的质量进行分离和 纯化。层析柱中的填 料是某些惰性的多孔 网状结构物质，多是 交联的聚糖(如葡聚糖 或琼脂糖)类物质，使 蛋白质混合物中的物 质按分子大小的不同 进行分离。
❖ 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AP）
❖ 葡萄糖氧化酶 （glucose-oxidase，GO）
三、抗体的酶标记
❖过碘酸钠氧化法 ❖戊二醛法
过碘酸钠法
❖ HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性 无关的多糖羟基氧化为醛基。
❖ 此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结 合，形成HRP—CH2—NH—IgG。
标记抗体技术
标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技 术，主要有以下3大类。
❖免疫荧光抗体技术 ❖免疫酶技术 ❖放射免疫分析
标记抗体
❖ 为什么要进行标记抗体？ ❖ 什么是二抗？
免疫酶标记技术
❖ 酶联免疫吸附试验
（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ，ELISA）
assay）
是一类常用的免疫酶技术。是将已知的 抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗 原抗体反应在固相表面进行。
常见抗体标记技术之三：抗体的生物素化标记
常见抗体标记技术之三：抗体的生物素化标记基本原理本法可使抗体或其它蛋白质的e-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。
其后,生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。
小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础试剂及仪器NHSB:N-羟基琥珀酰亚胺生物素(有商品供应)0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液,pH8.0(见附录双蒸水(注意去除游离氨基),用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液DMS0(二甲亚砜,有毒试剂)叠氮钠(有毒试剂)10g/L牛血清白蛋白(W/W)PBS液分子筛柱电磁搅拌器透析袋(MWCO8000)铝铂微量移液器操作步骤1.将待生物素化的蛋白质用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)稀释到1mg般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml2.交互用0.1mo1/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6),对蛋白质充分透析3.用 1m1 DMS0溶解 NHSB Img4.向1m1蛋白质溶液(即含蛋白质1mg)加入120u1NHSB溶液(即含NHSB120g)5.在室温下持续搅拌,保温2-4小时6.加入9.6μL1mol/LNH41(每25μ g NHSB加1u1),在室温下搅拌10分钟7.在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素8.将样品上1ml的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1ml/管,蛋白质在1-3m1之间洗下9.最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。
将结合产物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置一20℃保存质量监测与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素( neutravidin),通过标准方法( Westerblotting或免疫荧光染色法)测定交联率实验要点及说明1.如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在,会抑制标记反应。
微球标记抗体的方法
微球标记抗体的方法说实话微球标记抗体这事儿，我一开始也是瞎摸索。
我试过用物理吸附的方法来标记，就想着让抗体像小虫子粘到蛛网上一样附着在微球上。
我先把微球和抗体混到一起，使劲儿摇晃，觉得这样就能让它们亲密接触然后结合了。
可结果呢，大失所望。
标记得特别不稳定，一检测就发现标记效果差得很，原来是这种物理吸附太弱了，稍微有点外界干扰就分开了。
后来我又尝试共价键结合的方法。
这就像搭积木，得把一个个小部件精准地拼接起来。
这个过程可复杂了，我得先对微球进行化学修饰，让它带上能和抗体反应的基团，当时我就像个小化学家似的，小心翼翼地调配各种化学试剂。
我试过好几种修饰试剂，有些反应太剧烈，一下子把微球弄坏了，有的又反应不完全，导致后面和抗体结合不好。
经过好多轮的试验，我才找到合适的修饰试剂和反应条件。
然后再把修饰好的微球和抗体放在一起反应，这个反应的时间、温度、酸碱度等等都得严格控制，就跟伺候一个娇贵的小宠物似的。
我曾经犯错，反应时间没掌握好，要么太短，导致没标记上，要么太长，产物就乱七八糟了。
再后来，这个过程我做了好多次才慢慢熟练。
还有一种方法是亲和素- 生物素系统介导的标记，这种方法就像是借助一个中间人来促成两者结合。
亲和素和生物素的结合能力超强。
但是这里面也有要注意的地方，亲和素容易有非特异性结合，这个时候就需要处理那些可能的结合位点，避免干扰标记。
不过在具体实验的时候，可能受到实验仪器，试剂纯度等各种外界因素影响，有的时候也得根据实际情况调整。
这么多尝试下来，我觉得共价键结合的方法虽然复杂，但只要掌握好了，标记的稳定性还是比较高的。
要是刚刚开始接触微球标记抗体的朋友，我的建议就是，一定要把基础的原理搞清楚，就像建房子要先打好地基一样。
要有耐心，每一步都多检查几遍，如果遇到失败别灰心，我这种一路失败过来的最后都能有点成果呢。
而且实验记录一定要详细，这样回头看自己犯错在哪就一目了然，可以少走好多弯路的。
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碱性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
HRP底物
HRP的底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
常用底物
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 5-氨基水杨酸5-ASA
是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒（
1-10nm）。
由II-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接受激 发光产生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布。 广义的量子点还包括 IV-VI 族、V-VI 族元素组成的 纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米 颗粒等。
量子点的光学特性
量子点表面修饰
无机壳层修饰法和化学修饰法是两种常用的量子点修饰 方法。 无机壳层修饰法 合成核/壳结构的量子点，如在CdSe量子点的外面包覆 一层CdS 或ZnS 就构成了以CdSe为核，以CdS 或ZnS 为壳的 量子点。 化学修饰法 用含巯基的有机分子如二氢硫辛酸、巯基乙酸和聚乙二 醇等对量子点进行表面修饰。
吖啶酯
在碱性条件下与H2O2 就可产生化学发光现象。在碱性介 质中氧化时，这些化合物经历共价键的断裂，经过一个二氧酮 的中间体，产生电激发的N-甲基吖啶酮，当它恢复到基态时， 在430nm出释放出光子。
AE特性
化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。 极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期 长达1 年甚至更久。 发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内 完成。
以制备16nm的胶体金为例，取0.01%的氯金酸水溶液
100ml，加热至沸腾，磁力搅动下加入1%的柠檬酸三钠水溶
液2ml，淡黄色的氯金酸溶液很快变灰色，继而黑色，随后
成酒红色。 金溶胶颗粒的直径取决于制备时加入的枸橼酸三钠量， 保持其他条件不变，制备时加入不同剂量的柠檬酸三钠可光素 稀土离子螯合物 荧光底物（酶作用后产生荧光的物质）
荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC） 四乙基罗丹明（rhodamine, RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC） 藻红蛋白(phycoerthrin, PE)
HPA具有荧光底物性质，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚
体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的
荧光。
H2O2
HRP
HO
CH2 COOH
+荧 光
HO
CH2 COOH
氧化二聚体
ALP底物
常用的ALP色原底物
对-硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP） 氯化硝基四氮唑蓝/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（nitroblue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate， BCIP/ NBT） 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferyl phosphate， 4-MUP）是ALP的发光底物之一。
其他荧光物质
某些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便具有强荧光。
如4-甲基伞酮-β -D半乳糖苷，受β -半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲
基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。 其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的 底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质。
AP
H3PO4 +
360nm 激发光
荧 光
β- Gal 荧光底物
常用4-甲基伞酮基-β -D半乳糖（4-methylumbellifery-
β -D-galactoside，4-MUG）作为底物，酶促反应后，产生高
强度荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA）
三、酶和酶作用底物
常用的酶标记物有
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)
β -半乳糖苷酶(β -galactosidase, β -Gal) 每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型
的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计测 量。
四、化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形
式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。
直接化学发光剂
酶促反应发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作
用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特 有基团，可直接标记抗原或抗体。
电化学发光剂
是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。
特点：①反应在电极进行；
②电子供体为：三丙胺（TPA）
③化学发光剂：三联毗啶钌
三联毗啶钌 分子结构图
O O N N Ru N N N N O O N
电化学发光剂
酶促反应发光剂
酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，
胶体金特性
具有胶体的多种特性
特别是对电解质的敏感性，电解质能破坏胶体金颗粒的
外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态。
胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同 最小的胶体金(2nm～5nm)是橙黄色，中等大小胶体金 (10nm～20nm)是酒红色，较大颗粒胶体金(30nm～80nm)则是 紫红色。
量子点调色功能
在紫外光激发下，相同组成不同粒径的量子点的发射光谱
量子点的制备
大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法。 物理制备法 可制得粒径易控的量子点，但所需实验设备昂贵，广泛使 用受限。 化学合成法有水相和有机相合成法 有机相体系 可制备性能优良的量子点，如 CdSe及CdSe/ZnS。 量子点 分散性好、稳定性高、不易沉积，但水溶性太差。 水相体系 操作简单、成本低廉、量子点表面形貌及性质可控、易修 饰各种基团。
胶体金制备原理
胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，聚合
成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。 常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷 、硼氢化钠等。 根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备 0.8nm～150nm不等的胶体金颗粒。
胶体金制备方法
常用的方法为柠檬酸三钠还原法
第二节 常用交联剂及特性
重点提示
均一的双功能交联剂
非均一的双功能交联剂
交联剂方法
交联剂
生物大分子之间的偶联，本质上是生物大分子中活 性基团之间的连接。
其连接类型主要有：-NH2与-NH2 、-NH2与-CO2H 、SH与-SH 、-NH2与-SH 、糖基(-OH)与-NH2 、-C=O与-NH2 等。 免疫标记常用交联剂分子两端各有一个相同或者不 同的活性基团，它们可与其它分子上的氨基、巯基、羟 基等基团发生共价结合而产生交联作用。
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT 双标记FAT、流式细胞 术
550nm
490-560nm
595nm（红色）
稀土离子
镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（ Sm3+）、铽(Tb3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）di和铈(Ce3+)等。 铕是标记抗原抗体应用最广的元素。 游离的稀土离子荧光比较弱，但与适当的螯合剂如β 萘甲酰三氟丙酮（β -NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA） 等形成螯合物后，可使荧光得到增强。 稀土离子的荧光特性如下： 具有较大的Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互 重叠。 荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000μ s之间。 激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。
这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。
鲁米诺及其衍生物 AMPPD
鲁米诺及其衍生物
鲁米诺发光原理
鲁米诺及其衍生物
鲁米诺增强发光反应原理
AMPPD
AMPPD
〔3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
五、量子点
量子点 QDs
量子点(quantimim dots, QDs)即半导体纳米粒子，
强度对被检物进行定性、定量分析。
辣根过氧化物酶HRP
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备
第一节
标记物的种类及特性
重点提示
放射性核素
荧光物质
酶和酶作用底物
化学发光剂
量子点 胶体金
第一节 标记物的种类及特性
标记免疫技术 = 免疫技术 + 标记技术