第七章 抗体的标记

AP
H3PO4 +
360nm 激发光
荧 光
β- Gal 荧光底物
常用4-甲基伞酮基-β -D半乳糖（4-methylumbellifery-
β -D-galactoside，4-MUG）作为底物，酶促反应后，产生高
强度荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基β-D 半-乳糖苷 （ 4MUG ）
碱性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶
碱性磷酸酶（AP）
菌源性AP 肠粘膜AP
β–半乳糖苷酶（β-Gal）
用于均相酶 免疫测定
HRP底物
HRP的底物
HRP
DH2+H2O2→ → → D+2H2O
H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种
常用底物
四甲基联苯胺 TMB HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 5-氨基水杨酸5-ASA
量子点调色功能
在紫外光激发下，相同组成不同粒径的量子点的发射光谱
量子点的制备
大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法。 物理制备法 可制得粒径易控的量子点，但所需实验设备昂贵，广泛使 用受限。 化学合成法有水相和有机相合成法 有机相体系 可制备性能优良的量子点，如 CdSe及CdSe/ZnS。 量子点 分散性好、稳定性高、不易沉积，但水溶性太差。 水相体系 操作简单、成本低廉、量子点表面形貌及性质可控、易修 饰各种基团。
第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备
第一节
标记物的种类及特性
重点提示
放射性核素
荧光物质
酶和酶作用底物
化学发光剂
量子点 胶体金
第一节 标记物的种类及特性
标记免疫技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪标记物
高特异性 精密仪器检测
既可以与抗原或抗体相结合，
又可以被相应的仪器所检测 的物质，这就是标记物
荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强 所谓光漂白是指由光激发引起发光物质分解而使荧光强 度降低的现象。有机荧光色素的光漂白速率很快，而量子点 的光漂白作用则小得多。 具有“调色”功能，一元激发多元发射 不同粒径的量子点具有不同的颜色，可用同一波长的光 激发不同大小的量子点，获得多种标记颜色。 激发光波长宽，而发射光波长窄 量子点的激发光波长范围很宽，具有较大的Stokes位移 和狭窄对称的荧光谱峰。
以制备16nm的胶体金为例，取0.01%的氯金酸水溶液
100ml，加热至沸腾，磁力搅动下加入1%的柠檬酸三钠水溶
液2ml，淡黄色的氯金酸溶液很快变灰色，继而黑色，随后
成酒红色。 金溶胶颗粒的直径取决于制备时加入的枸橼酸三钠量， 保持其他条件不变，制备时加入不同剂量的柠檬酸三钠可获 得不同粒径的胶体金颗粒。
二、荧光物质
有机化合物荧光素 稀土离子螯合物 荧光底物（酶作用后产生荧光的物质）
荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC） 四乙基罗丹明（rhodamine, RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC） 藻红蛋白(phycoerthrin, PE)
六、胶体金
胶体金（colloidal gold）也称金溶胶，是金盐被还原
成金原子后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双 离子层构成(内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷的H+)。 由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳 定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。
第七章
抗体的标记
目 录
第一节 标记物种类及特性
第二节 常见交联剂的种类及特性 第三节 放射性核素与抗原抗体结合物制备
第四节 荧光素与抗原抗体结合物制备
第五节 酶与抗原抗体结合物制备 第六节 化学发光剂与抗原抗体的结合物制备 第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备 第八节 量子点与抗原抗体的结合物制备
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT 双标记FAT、流式细胞 术
550nm
490-560nm
595nm（红色）
稀土离子
镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（ Sm3+）、铽(Tb3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）di和铈(Ce3+)等。 铕是标记抗原抗体应用最广的元素。 游离的稀土离子荧光比较弱，但与适当的螯合剂如β 萘甲酰三氟丙酮（β -NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA） 等形成螯合物后，可使荧光得到增强。 稀土离子的荧光特性如下： 具有较大的Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互 重叠。 荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000μ s之间。 激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。
简单
小
复杂
大
射线
半衰期 测量条件
γ
60d 简单
β
12.3y 复杂
放射性核素125I特点
化学性质较活泼，标记方法简单，容易获取高比活性的标
记结合物；
衰变过程不产生电离辐射强的β 射线，对标记多肽，蛋白 抗原分子的免疫活性影响小； 衰变过程中释放γ 射线，可用γ 计数器测量，方法简便， 易推广应用； 半衰期(60天)适中、核素丰度(>95％)及计数率相对较高。
其他荧光物质
某些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便具有强荧光。
如4-甲基伞酮-β -D半乳糖苷，受β -半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲
基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。 其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的 底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质。
HPA具有荧光底物性质，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚
体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的
荧光。
H2O2
HRP
HO
CH2 COOH
+荧 光
HO
CH2 COOH
氧化二聚体
ALP底物
常用的ALP色原底物
对-硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP） 氯化硝基四氮唑蓝/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（nitroblue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate， BCIP/ NBT） 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferyl phosphate， 4-MUP）是ALP的发光底物之一。
常用的荧光素特性
荧光物质 最大吸收光谱 最大发射光谱 应用
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm
520～530nm （黄绿 色）
FAT、荧光偏振免疫测 定
四乙基罗丹明 (RB200)
四甲基异硫氰酸 罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
570～575nm
595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双 标记FAT
胶体金特性
具有胶体的多种特性
特别是对电解质的敏感性，电解质能破坏胶体金颗粒的
外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态。
胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同 最小的胶体金(2nm～5nm)是橙黄色，中等大小胶体金 (10nm～20nm)是酒红色，较大颗粒胶体金(30nm～80nm)则是 紫红色。
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
HRP的常见底物
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA）
第二节 常用交联剂及特性
重点提示
均一的双功能交联剂
非均一的双功能交联剂
交联剂方法
交联剂
生物大分子之间的偶联，本质上是生物大分子中活 性基团之间的连接。
其连接类型主要有：-NH2与-NH2 、-NH2与-CO2H 、SH与-SH 、-NH2与-SH 、糖基(-OH)与-NH2 、-C=O与-NH2 等。 免疫标记常用交联剂分子两端各有一个相同或者不 同的活性基团，它们可与其它分子上的氨基、巯基、羟 基等基团发生共价结合而产生交联作用。
这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。
鲁米诺及其衍生物 AMPPD
鲁米诺及其衍生物
鲁米诺发光原理
鲁米诺及其衍生物
鲁米诺增强发光反应原理
AMPPD
AMPPD
〔3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕
五、量子点
量子点 QDs
量子点(quantimim dots, QDs)即半导体纳米粒子，
常用底物
ALP的 底物
对-硝基苯磷酸酯 （ pNPP ）
经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
BCIP/ NBT常用于ELISPOT中的PVDF膜显色，在ALP的
催化作用下，BCIP被水解生成强反应性的产物，该产物 与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀
4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光 的作用下，发出450nm的荧光，可用荧光光度计进行测量。
酶作用后，生成高强度 荧光物 ，用荧光计测 量。
四、化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形
式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。
直接化学发光剂
酶促反应发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作
用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特 有基团，可直接标记抗原或抗体。
是指半径小于或接近于激子玻尔wk.baidu.com径的半导体纳米晶粒（
1-10nm）。
由II-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接受激 发光产生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布。 广义的量子点还包括 IV-VI 族、V-VI 族元素组成的 纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米 颗粒等。
量子点的光学特性
电化学发光剂
是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。
特点：①反应在电极进行；
②电子供体为：三丙胺（TPA）
③化学发光剂：三联毗啶钌
三联毗啶钌 分子结构图
O O N N Ru N N N N O O N
电化学发光剂
酶促反应发光剂
酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，
量子点表面修饰
无机壳层修饰法和化学修饰法是两种常用的量子点修饰 方法。 无机壳层修饰法 合成核/壳结构的量子点，如在CdSe量子点的外面包覆 一层CdS 或ZnS 就构成了以CdSe为核，以CdS 或ZnS 为壳的 量子点。 化学修饰法 用含巯基的有机分子如二氢硫辛酸、巯基乙酸和聚乙二 醇等对量子点进行表面修饰。
高灵敏性
标记物在免疫分析中
高精密性
的作用在于示踪标记 并能够被检测
一、放射性核素
在自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性
核素转变为另一种放射性核素，并同时释放射线，这一
转变过程称为放射性衰变。
依衰变方式分为：α 、β 、γ 。
一、放射性核素
常用标记核素
125I 3H
理化性
活泼
差
标记方法
对标记物 免疫活性的影响
强度对被检物进行定性、定量分析。
辣根过氧化物酶HRP
糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比 ELISA中应用最为广 泛的标记用酶
吖啶酯
在碱性条件下与H2O2 就可产生化学发光现象。在碱性介 质中氧化时，这些化合物经历共价键的断裂，经过一个二氧酮 的中间体，产生电激发的N-甲基吖啶酮，当它恢复到基态时， 在430nm出释放出光子。
AE特性
化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。 极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期 长达1 年甚至更久。 发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内 完成。
胶体金制备原理
胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，聚合
成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。 常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷 、硼氢化钠等。 根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备 0.8nm～150nm不等的胶体金颗粒。
胶体金制备方法
常用的方法为柠檬酸三钠还原法
三、酶和酶作用底物
常用的酶标记物有
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)
β -半乳糖苷酶(β -galactosidase, β -Gal) 每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型
的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光