直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原
吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析
DOI:10.16662/ki.1674-0742.2018.16.191吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测CCP抗体作用分析徐秋波,黄丽娟靖江市人民医院检验科,江苏靖江214500[摘要]目的分析对CCP抗体采用吖啶酯直接化学发光法和ELISA定量检测的临床作用。
方法方便选择2017年1月—2018年1月来该院检验科进行CCP抗检测的272例患者,所有患者均采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测,对各组检测结果进行分析比较。
结果采用吖啶酯直接化学发光法的CCP抗体诊断中,特异性为96.69%,敏感性为69.49%,阳性预测值与阴性预测值为87.13%、91.91%。
采用ELISA定量检测法的CCP抗体诊断中,特异性为97.06%,敏感性为68.01%,阳性预测值与阴性预测值为92.28%、86.03%;在类风湿性关节炎患者中,活动期CCP抗体含量(141.11±93.96)IU/mL,非活动期CCP抗体含量(45.15±10.56)IU/mL,由此可见类风湿性关节炎活动期CCP抗体含量明显高于非活动期(t=8.369,P=0.000);采用吖啶酯直接化学发光法与ELISA检测的CCP抗体,阴性符合率为100.00%,阳性符合率为94.44%,总符合率为98.53%。
结论针对CCP抗体,吖啶酯直接化学发光法与ELISA定量检测具有良好的符合率,吖啶酯直接化学发光法适合在仪器自动化中应用,易标准化,操作简单,与临床要求相符合。
CCP抗体作为类风湿性关节炎诊断的一种新血清学标志物,对类风湿性关节炎病情监测有利。
[关键词]吖啶酯直接化学发光法;ELISA定量检测;CCP抗体[中图分类号]R446[文献标识码]A[文章编号]1674-0742(2018)06(a)-0191-03 Quantitative Detection of CCP Antibody by Acridine Ester Direct Chemilu⁃minescence and ELISAXU Qiu-bo,HUANG Li-juanDepartment of Laboratory,Jingjiang People's Hospital,Jingjiang,Jiangsu Province,214500China[Abstract]Objective This paper tries to analyze the clinical effect of anti-CCP using acridinium ester direct chemilumi⁃nescence and ELISA.Methods272cases of CCP anti-detection were selected conveniently from January2017to January 2018in the laboratory.All patients were tested with acridinium ester direct chemiluminescence and ELISA.The results of each group were analyzed and compared.Results In the diagnosis of CCP antibodies using acridinium ester direct chemilu⁃minescence method,the specificity was96.69%,the sensitivity was69.49%,and the positive predictive value and negative predictive value were87.13%and91.91%.In the diagnosis of CCP antibodies using ELISA quantitative assay,the speci⁃ficity was97.06%,the sensitivity was68.01%,and the positive predictive value and negative predictive value were92.28% and86.03%;in patients with rheumatoid arthritis,active CCP antibodies content(141.11±93.96)IU/mL,inactive CCP anti⁃body content(45.15±10.56)IU/mL,it can be seen that the CCP antibody content of active rheumatoid arthritis was signifi⁃cantly higher than inactive period(t=8.369,P=0.000);CCP antibodies detected by acridinium ester direct chemiluminescence method and ELISA,the negative coincidence rate was100.00%,the positive coincidence rate was94.44%,and the overall coincidence rate was98.53%.Conclusion For CCP antibodies,acridinium ester direct chemiluminescence method and ELISA quantitative detection have a good coincidence rate,acridinium ester direct chemiluminescence method is suitable for application in instrument automation,easy standardization,simple operation,and in line with clinical requirements.As a new serological marker for the diagnosis of rheumatoid arthritis,CCP antibody is beneficial to the monitoring of rheumatoid arthritis.[Key words]Acridine ester direct chemiluminescence;ELISA quantitative detection;CCP antibodyantibody antibody[作者简介]徐秋波(1980-),女,江苏靖江人,本科,主管技师,主要从事检验科免疫检测工作。
体外分析技术
Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
？
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）——以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类（化学特性）
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。
乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０１９．０６．０３７ 收稿日期：２０１８０８３０；修回日期：２０１８１２１０ 通讯作者：颜光涛，研究员。研究方向：标记免疫分析技术。Ｅｍａｉｌ：ｙｇｔ３０１＠１６３．ｃｏｍ
１０５２
ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２０１９，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６
乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫 分析方法的建立
欧赛英１，潘杨滨１，陈秀发１，沙利烽１，梁 辰２，冯 杰２，薛 辉２，颜光涛２
（１．苏州长光华医生物试剂有限公司，江苏 苏州 ２１５１６３；２．中国人民解放军总医院医学检验中与临床 ２０１９年 ６月第 ２６卷第 ６期
１０５３
慢 性 乙 型 肝 炎 （乙 肝）病 毒 （ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ ｖｉｒｕｓ ＨＢＶ）感染可导致肝硬化和肝细胞癌等严重后果，从 而带来巨大 的 社 会 经 济 负 担，已 成 为 全 球 公 共 卫 生 问题。根据 ＷＨＯ公布数据，目前，全球 ６０亿人口中 约有 ２０亿感染过 ＨＢＶ，其中 ３．５亿为慢性感染者， 每年 约 有 ７８万 人 死 于 ＨＢＶ 相 关 性 肝 硬 化 和 肝 癌［１］。根据 ＨＢＶ基因组差异性大于 ８％，ＨＢＶ被分 成 １０种基因型（Ａ～Ｊ）及 ４０种不同的亚基因型，不 同基因 型 ＨＢＶ 流 行 病 学 特 征 不 同［２］。 ＨＢｓＡｇ是 ＨＢＶ感染后首先出现的血清标志物，预示价值高，是 目前临床上应用最多的血清标志物，也是 ＷＨＯ公认 的判断 ＨＢＶ感染的关键指标。随着检测技术的不 断发展，临床 检 测 和 血 筛 市 场 对 灵 敏 度 的 要 求 也 越 来越高，目前全球有多达上百个相关检测产品，包括 酶联免疫法、胶 体 金 标 记 法、化 学 发 光 等 分 析 方 法， 以化学发 光 法 的 灵 敏 度 为 最 佳［３］。 高 灵 敏 度、高 特 异性、以及定量检测是 ＨＢｓＡｇ检测的三大趋势。本 文根据化学 发 光 免 疫 定 量 分 析 的 原 理，采 用 吖 碇 酯 标记分析技术，用双抗体夹心法建立检测人血清 ／血 浆中 ＨＢｓＡｇ含量的方法，现将试验结果报道如下。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理 )
化学发光的检测方式
化学发光按检测方式分为： 随机处理模式：管式化学发光（磁微粒分离） 批处理模式： 板式化学发光（物理吸附）
板式化学发光
适合流行病调查、疾病预防与控制、体检中心，以及 医院血站等大样本检测项目的使用（比如HIV、TP、 HCV和乙肝两对半等）。
通常采用96孔白色不透明微孔板进行包被，不方便随到 随测和医院急诊；
发光底物（或发 光剂）
仪器检测
反应0-5分钟
鲁米诺化学发光系统
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统 O
H2O2+
NH
HRP
NH OH-
N2
NH2
O
增强剂（Enhancer）
CO2+Photon (425nm)
CO2NH2
OH
N
R
B
R
OH
OH
OH
R
S
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物
以碱性磷酸酶系统为例
间接化学发光
间接化学发光：用参与发光反应的 酶来标记抗原或抗体，免疫反应后 ，加入发光底物，测定发光体系的 发光强度来进行抗原或抗体的检测 。
两大反应体系：
辣根过氧化物酶（HRP）系统：氧化还原反应，稳定性差
源德、科美、安图
碱性磷酸酶（AP）系统：水解反应，灵敏度较高
其它
电化学发光
直接化学发光
直接化学发光：以化学物质,如异鲁 米诺、吖啶酯等直接标记抗原或抗体 ，免疫反应后，直接引发化学发光反 应进行检测。
产品：
吖啶酯标记 : 西门子Siemens Centaur XP CP 雅培Abbott Architect i2000
(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原
(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原直接化学发光免疫分析是一种广泛应用于生物医学研究和临床医学诊断的技术手段。
该技术以高灵敏度和高特异性为特点，能够快速准确地检测分子水平的生物标志物。
而吖啶酯作为直接标记抗体抗原的一种可行选择，具有独特的优势和应用潜力。
吖啶酯是一类荧光染料，具有发光能力，可以作为荧光标记物直接连接在抗体抗原上。
与传统的标记方法相比，吖啶酯直接标记具有操作简单、效率高等特点。
其原理是在免疫反应中，抗体与抗原结合形成复合物，吖啶酯标记物的发光信号则与目标分子的含量成正比，进而用于定量检测。
这种标记方式不仅可以用于体外实验室研究，还能够应用于临床检测中，如药物代谢动力学、肿瘤标志物的检测和传染性疾病的早期诊断等。
吖啶酯直接标记的优势主要有以下几个方面：首先，吖啶酯标记物具有较高的荧光强度和稳定性，使得检测结果更加准确和可靠。
吖啶酯荧光染料不仅在可见光区域有较高的发光强度，而且其激发和发射波长都与常用的荧光检测仪器相匹配，使得检测操作更加便捷和灵敏。
其次，吖啶酯直接标记的方法相对传统的标记方法更加简单快捷。
在传统的标记方法中，通常需要先标记抗体或抗原，再与荧光染料进行偶联，这个过程需要耗费较长的时间和精力。
而吖啶酯直接标记方法不需要额外的偶联试剂，只需将吖啶酯染料直接与抗体抗原接触，即可完成标记。
此外，吖啶酯直接标记方法在多种生物学实验中都能够获得良好的应用效果。
不同于一些其他的标记方法，吖啶酯直接标记不会影响抗体和抗原的结构和功能，确保了实验结果的可靠性和可重复性。
对于直接化学发光免疫分析技术的进一步发展，吖啶酯直接标记方法也值得进一步探索和研究。
虽然目前吖啶酯标记已经在一些实验和临床应用中得到了广泛应用，但是仍有一些问题亟待解决。
例如，吖啶酯标记物的发光强度和持久性有待进一步提高，以满足更高灵敏度和更长时间跟踪的需求。
此外，吖啶酯标记方法的选择性和特异性也需要进一步加强，以确保在复杂样本中的准确性和稳定性。
(精品)直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体抗原
化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以 发射光子的形式释放能量的化合物，称为化 学发光剂或发光底物。
㈠直接化学发光剂
直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需 酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化 学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记 抗原或抗体。
1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化 时,发出波长为470nm的光，具有很高的 发光效率，其激发态产物 N-甲基吖啶 酮是该发光反应体系的发光体。
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测定 法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散 射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法， 每项检测仅1～2min即可完成。
三、免疫散射比浊法
原理
粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关，其公式如下：
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
免疫自动化仪器分析技术
第一节 免疫浊度测定的自动化分析 第二节 发光免疫测定的自动化分析 第三节 荧光免疫测定的自动化分析 第四节 酶联免疫测定的自动化分析
第一节免疫浊度测定的自动化分析
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶液 中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、 NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反 应液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫 复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大， 即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS)底物技术报告
吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS）底物技术报告吖啶磺酰胺内盐（NSP-SA-NHS）是一种非常有效的化学发光免疫分析标记物质，用于标记抗体、抗原，开发化学发光免疫分析系统。
该发光物质较吖啶酯水解稳定性和热稳定性均提高。
NSP-SA-NHS或标记物在含过氧化物的稀碱性溶液中即能发光，背景发光低，干扰作用少，信噪比高，光量子产率也优于吖啶酯（AE-NHS）。
分子结构中含二酰亚胺（NHS）基团，易于与蛋白质联结，标记操作简单，重复性好。
标记后不影响蛋白活性，光子产率不减少、标记物稳定性好。
一、订货信息二、产品信息1、吖啶磺酰胺内盐•名称：NSP-SA-NHS；•外观：黄色固体粉末；•CAS NO.：199293-83-9•分子式：C32H31N3O10S2•分子量：681.7•结构式：•包装：避光容器；•用途：用于标记抗原或抗体；•储存条件和稳定期：避光，-20℃2年；•抗原抗体标记方法（具体项目标记方法需优化，此步骤仅供参考）：将待标记抗体用“标记缓冲液”稀释到1.0mg/ml。
注：抗体浓度应大于5.0mg/ml，若浓度低应先浓缩，如果怀疑抗体溶液内含干扰标记物质，应先更换抗体缓冲液为“标记缓冲液”；将NSP-SA-NHS用DMF稀释到2.0mg/ml；取离心管加入上述抗体溶液，加入上述NSP-SA-NHS/DMF溶液，每mg抗体加入22.8μl NHS溶液。
涡旋混匀后室温反应30-60min。
注：分子比例为抗体：NSP=1：10，根据项目情况，可对标记比例适当优化。
标记其他蛋白物质，投料分子比也建议在1:10，根据蛋白分子量计算需要加入的NHS溶液体积。
按照每标记1mg抗体，加入20μl “终止缓冲液”，混匀后室温反应30min终止反应；注1：标记缓冲液•碳酸缓冲液0.1M pH8.5注2：纯化缓冲液•磷酸盐：0.1M•NaCl：0.9%•NaN3：0.01%•BSA：0.1%•PH： 6.3注3：终止缓冲液•碳酸盐：0.1M•赖氨酸：10%•pH：8.52、激发液•名称：Triger-A、Triger-B；•外观：无色透明液体；•包装：白色容器；•用途：用于激发NSP或NSP标记物发光；•储存条件和稳定期：2-8℃2年，室温6个月；•检测推荐使用方法：先加入Triger A 200μl，混匀后加入Triger B 200μl，立即检测1-4秒内发光信号（发光信号峰值在0.4秒左右，90%以上信号在1秒内，最长仅可持续5秒，见图1.）；图1. NSP发光反应动力学三、使用注意事项：•NSP-SA-NHS应低温避光保存，开瓶前平衡到环境温度，避免潮解，潮解会造成NHS基团失活，影响标记效率；•激发液平衡到室温（22-35）℃后再使用，开瓶后连续使用时建议室温保存；•NSP-抗原/抗体标记物一般使用工作浓度在0.5-2.0μg/ml，具体项目需优化；•NSP激发后发射光子最大吸收波长在430nm；•NSP及标记物在弱酸性（pH≈5.0）及酸性条件下很稳定。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性），并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质（免疫反应性）。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光免疫分析方法的种类
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光
A 吖啶酯发光
原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。
代表仪器：拜耳公司的ACS180。
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
C 电化学发光
原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
【化学发光免疫分析种类】
•2、酶促化学发光或持久发光
•原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标
记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。
•特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。
•代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。
免疫检验质控
免疫检验自动化仪器 复习考查题
1、化学发光免疫分析仪的检测原理 2、酶联发光免疫分析仪的检测原理 3.电化学发光免疫分析仪的检测原理
2
答案
1、直接化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标记抗体 或抗原，以磁性微粒为固相载体的一种自动化免疫分析仪器， 直接（吖啶酯标记）发光只需加入氧化剂和pH纠正液，不 需要酶催化。
从一级标准的值传递到最终试验所使用的校准物的过程通 常由几个校准步骤组成, 包括标准品和测定方法、缓冲液 及其基质、稀释的控制、最终结果的统计学评价和质量控 制等。不同的分析物如血清蛋白、多肽激素或与载体蛋白 结合的低分子量激素等其校准过程有所不同。
标准品值的溯源模式图见图19-1。
22
校准品值溯源模式图
17
（二）标准品值的溯源
标准品的特性应该清楚明确, 理想的标准品应该是纯品, 但如特定 分析物质具有同种型不均一性, 则相应的标准品也应具备这种特点。 这种要求通常难以满足, 因为在纯化过程中, 使用生化方法去除杂 质会引起特定物质同种型的少量丢失。而使用免疫亲和层析纯化, 则由于洗涤过程常需在低pH变性条件下进行, 有可能会引起某些 蛋白的不可逆修饰。基因重组蛋白, 一是表达产物仍需纯化和糖基 化, 二是糖基化可能与天然蛋白有所不同。目前, 真正具有国际参 考物质的免疫测定项目并不多, 国家临床实验室标准化委员会 (National Committee of Clinical Laboratory Standardisation, NCCLS)以及美国和加拿大临床化学协会(American Societies for Clinical Chemistry and Canadian Societies for ClinicalChemistry and Canadian, AACC和CSCC)等正致力于 免疫测定的标准化工作, 这些组织也制备一些标准品。
化学发光免疫分析方法及其应用
化学发光免疫分析方法及其应用摘要】化学发光免疫分析方法因其具有灵敏度好、分析速度快、所需的设备简单等一系列优点，在医药、食品、环境检测等领域均有广泛地研究和应用。
在实际的工作中，由于经典的化学发光免疫分析法对大量复杂的样品测定所需时间长、成本高、样品用量大等不足，不能满足实际需要。
因而，建立快速、高灵敏度、高通量和低成本的检测方法成为化学发光免疫分析方法的研究热点和发展趋势。
鉴于此，本文主要对近几年化学发光免疫分析方法的种类以及免疫分析方法的研究应用进行探讨。
【关键词】化学发光免疫；分析；方法；应用【中图分类号】R927.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）01-0360-021.化学发光免疫分析方法的种类化学发光免疫分析方法的发光机理是在化学发光反应体系中的反应物、中间体等物质分子，吸收了化学反应释放的能量，由此这些分子从基本状态活跃到激发状态，然后又从激发状态返回到基本状态中，在此过程中会释放能量的光，而免疫分析方法就是对这些光进行测定及定量分析。
化学发光免疫分析方法包括免疫化学反应和化学发光反应两大部分。
免疫化学反应发光分析是把化学发光物质或酶通过化学方法标记在抗原或抗体上，然后抗原与抗体会发生特异性反应，继而形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析就是上述所说的，使化学发光体从激发状态返回到基本状态，主要在化学免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，通过氧化形成处于激发态的中间体，这时发光体会释放能量回到稳定常态。
1.1化学发光免疫分析化学发光免疫分析是十分常见的一种化学发光免疫分析方法，具体而言是直接利用化学发光剂对抗体和抗原进行直接标记的方法，常见的化学发光剂主要有两类，分别是鲁米诺和吖啶酯类发光剂。
首先介绍吖啶酯类标记剂的化学发光免疫分析。
吖啶酯类化学发光剂产生的原因主要是因为热稳定性不佳，最终合成热稳定性较好的吖啶酯类衍生物。
吖啶酯类化学发光剂的优点就在于化合物量子的产率相对较高，可以达到0.05，在标记的过程中，并且不需要加入催化剂，发光体系简单且快速，具有标记效率高、成本低的诸多特点。
吖啶酯在免疫分析及DNA测定中的应用
吖啶酯在免疫分析及DNA测定中的应用摘要：吖啶酯作为一种高效的化学发光试剂，在临床免疫分析，DNA 分析，生物酶活性测定等方面有着广泛的应用。
本文重点介绍吖啶酯在免疫分析及 DNA 测定中的应用。
其中在免疫分析方面可以用于标记，跟踪蛋白等，在DNA方面，可用于基因测定或微生物测定。
关键词：吖啶酯, 免疫分析, DNA测定,应用前言吖啶酯衍生物是一类量子产率较高的化学发光试剂，由于它发光过程所需的引发剂少、背景和噪音低、灵敏度高，常用于临床免疫测定，作核酸分子探针，测定生物酶的活性或其它应用[84-89 ]，可以标记抗体广泛应用于免疫测定；这类化合物只要在过氧化氢存在下就迅速产生化学发光，具有很高的化学发光效率。
又由于吖啶酯具有与乙酰苯酯相似的结构，具有单一酯键，检测的灵敏度高，因此可用于酶活性的检测。
目前，亚科化学主要推出了以下吖啶酯衍生物：吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)，黄色粉末，CAS号: 194357-64-7，分子式: C30H26N2O9S，分子量：590.6，含量：≥95.0%，储存条件：2-8℃冷藏，密封、干燥、避光保存。
吖啶盐(NSP-SA-NHS)，黄色粉末，CAS号: 199293-83-9，分子式: C32H31N3O10S2分子量: 681.733，含量：≥97%，贮存条件：常温。
吖啶盐(DMAE-NHS)，黄色粉末，CAS号: 115853-74-2，分子式: C29H26N2O10S，分子量: 594.589。
吖啶酯的应用吖啶酯在免疫分析中的应用Ianweek L 等人合成了[4-2-琥珀亚胺氧代碳酰乙基)-酚]10-甲基吖啶 9-甲酸苯酯，用它标记在抗体上测定人α-胎蛋白，其检测灵敏度为1.3kiloIU／L，与放射免疫法分析结果一致。
RichardsonAP 报道的吖啶酯 10-甲基吖啶 9-甲酸对氨基苯酯，标记在黄体酮上作半抗原，测定非怀孕灰女血浆中的黄体酮含量，其检测灵敏度达 0.64mol/L。
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展 蒋恩彬
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展蒋恩彬摘要]本文主要对化学发光免疫分析技术及其应用研究进展进行了分析，首先对化学发光免疫分析技术的相关概念进行了分析；然后从临床检验和兽医学应用化学发光免疫分析技术进行了分析；最后对化学发光免疫分析技术进行了新进展研究，希望对有关人士有所帮助。
[关键词]化学发光免疫分析、临床检验、兽医学一、前言由于化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、适用范围广泛等特点，所以受到了人们的认可，在医学、药品等众多领域得到广泛的应用。
同时化学发光免疫分析主要利用了化学发光测定技术和免疫反应，化学发光测定技术传统的免疫分析，需要的培育时间比较长。
二、化学发光免疫技术的工作原理1、检测器的检测原理化学反应的检测过程中，一些化学基团在处于被氧化状态之后，会形成一个激发态，在回归至基态的过程中，会发射出光子，实质上就是免疫反应与化学反应有机结合在一起之后形成的一种分析方法，即微量倍增技术。
微量倍增技术在临床检验中的应用，主要是通过粒径比较小的颗粒磁粉增大复合物表面的面积，提升复合物的吸附量，加强表面能，以此加快反应速度。
2、基本原理化学发光免疫技术，反应过程主要包括两类，即化学发光反应与免疫反应。
化学发光免疫技术的工作原理，主要是在抗体或者抗原上对化学发光物质或者其它一系列处于发光状态的酶标记物进行标记，使其产生免疫反应，使抗体与抗原能够特异性结合，产生一种复合物，然后在该复合物中加入发光底物或者氧化剂，使复合物可以发光。
根据待测物质具备的浓度与仪器监测中获取的发光强度之间存在的线性关系，实现浓度的合理测定。
三、化学发光免疫分析的分类化学发光免疫分析根据应用于免疫分析体系中的方式不同，可以分为以下三类：1、直接标记发光物质的免疫分析这种分析方式是用吖啶酯直接标记抗体，作为抗原，然后与待测标本中相应抗体发生免疫反应，就会形成固相包被抗体一待测抗原一吖啶酯标记抗体复合物，到这一步后再加入双氧水氧化剂，这样环境就会呈碱性，吖啶酯就会在不需要催化剂的情况下分解、发光。
化学发光免疫分析(CLIA)原理
化学发光免疫分析（CLIA）原理化学发光免疫分析（CLIA）就是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。
它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。
CLIA的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。
这里的化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。
某些反应的产物生成后会吸收反应释放的能量，从而跃迁至激发态，然后又回到基态，过程中产生光辐射，就是发光。
免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。
免疫学的发展主要经过了三个阶段：放射免疫法（RIA）已经处于衰退期，仍普遍用于县级以上医院，试剂系列化；酶联免疫发（ELISA）普遍用于临床机构，产品成熟，试剂尚未系列化（运用色原ADPS，TOOS，MAOS等同过氧化氢偶联的方法就是属于此类）；化学发光免疫法（CLIA）这个是比较先进的方法，个别较大医院应用，在国外已经比较成熟，但国内尚属于导入期或成长期，主要依赖进口。
化学发光的底物主要有如下几类：一、酶促反应的发光底物：鲁米诺，AMPPD等（德晟科技生产的还有异鲁米诺及鲁米诺钠盐）以鲁米诺发光原理为例：鲁米诺的发光原理：鲁米诺在碱性条件下，过氧化氢（氧化剂）以及酶的存在下，生成一种具有发光性能的电子激发态的中间体3-氨基邻苯二甲酸。
由激发态转化为基态的过程中，以光子的形式释放出的能量，波长位于可见光的蓝色部分。
用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗原（或抗体），在与反应体系中的待测物标本与固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体的复合物（洗涤清除未发生免疫结合成复合物上的抗原及标记抗体），这时加入鲁米诺发光剂，过氧化氢和发光增强剂是产生化学发光。
常用的化学发光试剂有哪些？
化学发光免疫分析中常用化学发光试剂有哪些？化学发光免疫测定是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。
主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等等优点。
用作标记的化学发光试剂应符合的条件鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是较常用的标记发光剂，它们符合以下几种条件：1、能参与化学发光反应。
2、与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂。
3、偶联后仍保留高的量子效应和反应动力。
4、应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特别是免疫活性。
化学发光免疫分析中所使用的标志物分类（一）直接化学发光剂直接化学发光剂指的是直接用化学发光剂标记抗原或抗体，主要有如下几种。
1、吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时，发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
吖啶酯类发光剂可直接用于标记半抗原和蛋白质等。
用于标记抗体时，结合稳定，结合后并不减少光量子的产生，可获得较高的比活性，有利于双位点化学发光免疫分析的建立，吖啶酯是较为理想的发光底物。
2、三联吡啶钌三联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。
（二）酶促反应发光剂：利用标记酶（辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）的催化作用，使发光剂（底物）发光。
1.辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；除此之外还有异鲁米诺及其衍生物都有化学发光特性，鲁米诺是最早合成的发光物质。
2、碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD，AMPPD是一种新的化学发光剂，其分子结构中有两个重要部分，一个是连接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸基团，它维持着整个分子结构的稳定。
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（三）方法评价
优点: 灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确
不足: ①抗体用量较大； ②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。
二、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2 μm）， 在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳 颗粒凝聚 ，使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示：a为单 个胶乳颗粒不阻碍光线透过，b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗 粒使透射光减弱或散射光增强。
自动化免疫浊度分析
一、免疫透射比浊法
（一）原理：
一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液 时，被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而 减弱，在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正 相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和 抗体的量呈正相关。与已知浓度的抗原标准品比较， 可确定标本中抗原含量。
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
定时散射比浊法测定原理示意图
(二)速率散射比浊法（rate nephelometry）
速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测 定法。连续测定各时间复合物形成的速率与其产生 的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比 浊法，每项检测仅1～2min即可完成。
（二）方法评价
本法敏感度大大高于普通比浊法，可达ng/L水平， 操作简便，易自动化；血清中的类风湿因子(RF)可 与IgG Fc段结合，使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异 性凝集，用F(ab’)2片段代替IgG既可消除此干扰， 又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象；免疫胶乳轻度 自凝或抗体活性降低会严重影待检标本和抗原参考品作适当稀释。
2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准 品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗 原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。
3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线 拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算 出抗原浓度。
式I θ中为与入射光成θ角处散射光强度；λ和I0为入 射光的波长和强度；dn/dc为校正因子，反映了溶液折 射指数和颗粒浓度的变化；M为颗粒分子量；c为浓度； N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离；θ为散 射光与入射光的夹角（散射夹角）。
散射颗粒与散射光
• 两种散射：Rayleigh-散射（颗粒直径<<入射光波长: 均匀散射）、Mile-散射（颗粒直径≈或>入射光波长: 不均匀散射）
第十四章 临床免疫检验自动化分析
免疫检验自动化 （automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、 温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报 告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制，自动化 进行。
• 20世纪50-80年代:免疫学检测主要是手工操作 • 20世纪80年代末:随着单克隆抗体技术、免疫标
免疫散射比浊法
• 定时散射比浊法 • 速率散射比浊法
(一)定时散射比浊法（fixed time nephelometry）
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下，加入 待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段， 溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号 计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法 是避开抗原抗体反应的不稳定阶段，即散射光信号 在开始反应7.5s～2min内的第一次读数，专门在抗 原抗体反应的最佳时段进行读数，将检测误差降到 最低。
1. 仪器测定技术要点
• 检测分两时间进行： – ①预反应阶段----加少量样本与抗体反应，测定 第一次散射光信号（7.5-120s）； – ②反应阶段----加入全量待测样本，4分钟内测定 第二次散射光信号。
• 第二次散射光信号作为待测抗原与抗体形成复合物 颗粒产生的信号峰值，经计算机软件处理转换为待 测抗原浓度。
记技术以及计算机技术的出现，自动化免疫分析 技术引入临床
- 提高检测灵敏度，增加检测项目 - 缩短检测时间 - 提高实验结果的精确度和准确度
自动化免疫分析仪的共同特点
主机系统
样本处理 系统
试剂 系统
温育反应 系统
信号检测 系统
计算机系统
自动稀释 自动进样 自动清洗
信号处理及 数字转换
信号储存 分析报告
三、免疫散射比浊法
原理
粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关，其公式如下：
Iθ＝ I0［4π2（dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)］ Nγ2λ4
• 速率-----指抗原抗体结合反应过程中，每一单 位时间内两者结合的速度。
抗原抗体复合物形成表
累积时间（秒）
复合物形成的量
形成速率值
5
8
-
10
13
5
15
25
12
20
60
35
25
150
90
30
230
80
35
300
• 大多数蛋白质分子直径比光波长小很多，因而只产 生Rayleigh-散射
• Rayleigh散射：散射光的强度与复合物的量呈正比、 与入射光波长成反比。
• 散射免疫比浊分析时一定要保持抗体过量，以维持 抗原抗体复合物的相对不溶解性；
• 测定的散射信号值应在曲线的上升臂部位，浊度信 号与待测抗原量呈正比。
免疫自动化仪器分析技术
第一节 第二节 第三节 第四节
免疫浊度测定的自动化分析 发光免疫测定的自动化分析 荧光免疫测定的自动化分析 酶联免疫测定的自动化分析
第一节免疫浊度测定的自动化分析
免疫浊度分析的基本原理是：抗原、抗体在特定的电解质溶 液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、 NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应 液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复 合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增大，即 待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。