抗体标记技术汇总
第六节免疫标记技术
第十一章血清学试验第六节免疫标记技术免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。
免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。
它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。
其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。
这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。
一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque ）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。
（一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。
（二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。
主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。
它们受到激发光（如紫外光）照射后，可发射荧光。
可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄（FITC）、四乙基罗丹明（RB 200）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC。
其中FITC M用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490〜495nm,最大发射光波长520〜530nm可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性（pH9.0〜9.5）条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
（三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。
抗体标记流式分选
抗体标记流式分选
抗体标记流式分选是一种高效、精确的细胞分选技术，广泛应用于生物医学研究、药物研发和临床诊断等领域。
该技术利用特异性抗体与细胞表面分子的结合，将目标细胞从混合细胞群中分离出来，实现单细胞级别的分选和分析。
抗体标记流式分选的基本原理是将细胞样品与特异性抗体标记结合，形成抗原-抗体复合物。
这些复合物在流式细胞仪中通过激光束的照射，产生荧光信号，从而实现对细胞的快速、准确的检测和分选。
该技术具有高通量、高灵敏度、高分辨率等优点，能够同时检测多种细胞表面标记物，实现多参数分析和分选。
抗体标记流式分选在生物医学研究中的应用非常广泛。
例如，在肿瘤学研究中，该技术可以用于分离肿瘤细胞和正常细胞，研究肿瘤细胞的生物学特性和治疗靶点；在免疫学研究中，该技术可以用于分析免疫细胞的表型和功能，研究免疫应答机制和免疫调节；在药物研发中，该技术可以用于筛选药物靶点和评估药效；在临床诊断中，该技术可以用于检测血液、尿液等样品中的肿瘤细胞、病原微生物等。
抗体标记流式分选是一种重要的细胞分选技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和完善，相信该技术将在生物医学研究和临床诊断中发挥越来越重要的作用。
免疫标记技术名词解释
免疫标记技术名词解释免疫标记技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术。
它利用特异性抗体与待检测的分子结合，然后利用这些抗体上的标记物（如酶、荧光剂或放射性同位素）来检测和定量目标分子的存在和表达水平。
下面是一些常见的免疫标记技术及其解释：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：在组织切片或细胞上，利用抗体与特定抗原结合，再利用染色剂（如酶、荧光剂）将目标抗原可视化，从而研究和分析细胞或组织中特定蛋白质的表达和定位情况。
2. 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）：通过与荧光素结合的抗体，将特定蛋白质或其他目标分子在细胞或组织中可视化。
这种技术不仅可以用于检测蛋白质的表达和定位，还可以用于研究细胞的功能、相互作用和信号通路等。
3. 免疫酶标记（Immunoenzymatic labeling）：利用酶标记（如辣根过氧化物酶-HRP）结合抗体，形成特定酶抗体复合物。
通过加入合适底物和显色反应，可以观察到酶的活性，从而实现对目标分子的检测和定量。
4. 免疫原位杂交（Immunohistochemical In Situ Hybridization，IHC-ISH）：结合免疫组化和原位杂交的技术，可以同时检测细胞或组织中的蛋白质表达和基因表达情况。
通过使用标记有荧光或酶的核酸探针，可以在组织切片或细胞上可视化特定基因的表达位置。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：该技术利用荧光标记的抗体与细胞中的特定分子结合，经过流式细胞仪检测细胞的荧光强度和分布情况。
这种技术可以用于检测和分析细胞表面标记物、细胞周期、凋亡等多种细胞特性。
免疫标记技术的应用范围非常广泛，可以用于癌症诊断、药物研发、免疫学研究和疫苗开发等领域。
通过免疫标记技术，科研人员可以更加准确地了解分子的功能、定位以及其在疾病中的变化，从而为疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。
抗体的标记——精选推荐
抗体的标记在绝大多数情况下，当抗体分子被应用于研究时均需要被标记。
依据实验目的之不同，所采用的标记方法和标记物通常也是不同的。
一、抗体的标记的直接法与间接法（一）直接法直接法是将纯化后的抗体先与一标记物直接结合，然后再与靶分子（抗原）结合，通过检测抗体所携带的标记物来对靶分子（抗原）进行定性、定位、定量测量的方法。
（二）间接法间接法与直接法不同，抗体既不需纯化也不需标记，而是在抗体与相应靶分子（抗原）结合后，洗去未结合抗体，然后通过利用已标记好的第二抗体（二抗）与一抗的结合来间接标记出靶分子（抗原）的存在情况。
此方法带有比直接法更多的标记物，因此较直接法灵敏。
二、标记物的选择无论是直接法还是间接法，标记物的选择至关重要。
表1-2-1所列出的就是一些常用标记物及其相应的检测方法和优缺点等。
表1-2--1 标记物的选择标记物检测方法优点缺点应用生物素与各种标记物偶联的亲和素与链霉亲和素保存时间长，灵敏度高，检测手段多样步骤过多，存在内源性生物素干扰，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹荧光色素荧光显微镜或荧光计保存时间长，分辨率高自发荧光，易淬灭免疫组化酶底物显色保存时间长，灵敏度高，肉眼直接可见，检测手段多样步骤过多，存在内源性酶的干扰，分辨率低，有些底物对人体有害免疫组化、免疫印迹125I或131Iγ计数仪、放射自显影易于直接标记，灵敏度高半衰期短，对人体有害免疫印迹、定性定量免疫分析生物合成放射自显影、β计数仪不损伤抗体、操作简便半衰期短，敏感性低，需杂交瘤细胞免疫印迹、定性定量免疫分析胶体金显微镜、电镜、肉眼特异性强、灵敏度高、应用范围广、可用于双重和多重标记对试剂、玻璃器皿内的要求极高，标记物浓度较高免疫组化、流式细胞术、定性定量免疫分析第二节免疫组织（细胞）染色技术一、基本概念免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）是用经标记的特异性抗体在组织细胞原位通过特异性抗原抗体反应和化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术第一节抗体的I125标记法基本原理有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。
当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。
蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。
在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。
该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。
试剂及仪器●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1)●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液●凝胶过滤柱●γ-记数器●100g/L 三氯醋酸●70% 乙醇●玻璃纤维滤●氯胺T (Chloramine T)反应用* 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）；* 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。
操作步骤*注意：125I 对健康有害，需要保护措施。
在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。
（一）氯胺T法1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；2．加500 μCi 的Na125I ，混匀；3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀；4．在室温下培养1分钟；5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）；6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。
临床常用标记免疫技术及特点
临床常用标记免疫技术及特点1.引言1.1 概述标记免疫技术是现代生物医学领域中常用的一种实验方法，其通过在生物样本中引入特定的标记物，来检测、定量或分析目标物质的存在和性质。
这些标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶或其他具有特异性的物质。
在临床医学中，标记免疫技术具有广泛的应用，可以用于诊断疾病、评估治疗效果、研究疾病机制等方面。
常用的标记免疫技术包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)等。
免疫荧光染色技术是一种利用特异性抗体与标记物结合后发出荧光信号的技术。
通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，可以定位、鉴定并定量分析目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的特点。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种利用特异性抗体与酶结合后，通过酶催化反应来产生可定量的信号的技术。
ELISA技术可以用于检测血清中的免疫球蛋白、抗原、抗体等多种生物分子，并可定量测定其浓度。
ELISA 技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点。
放射免疫测定(RIA)是一种利用放射性同位素标记分子，通过测量放射性同位素放出的射线来定量目标物质的技术。
RIA技术在测定极低浓度物质或微量物质时具有非常高的敏感性和特异性。
然而由于放射性同位素标记物的安全性和环境污染问题，RIA技术在临床实验室中的应用受到了限制。
总之，标记免疫技术在临床医学中具有重要的应用价值，可以帮助医生准确、快速地诊断疾病，评估治疗效果，深入研究疾病的发生机制。
随着科学技术的不断进步，标记免疫技术也在不断发展，将为临床医学带来更多的突破和进展。
1.2文章结构文章结构部分：本篇文章主要介绍临床常用标记免疫技术及其特点。
文章结构如下：第一部分为引言，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，将介绍免疫技术在临床应用中的重要性和广泛应用的背景。
在文章结构部分，将详细说明本篇文章的章节分布和内容安排。
在目的部分，将说明本文的目的和意义，为读者明确文章的目标。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法是实验室中常用的技术手段，用于检测和定位特定分子或细胞的存在和分布。
常见的抗体标记方法包括荧光标记、酶标记和放射性标记。
这些方法的比较原理如下：
1. 荧光标记：荧光标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，在荧光显微镜下显示特定波长的光信号。
这种标记方法具有高灵敏度、高特异性和多色标记的优势，使其广泛应用于细胞和组织的免疫染色、流式细胞术和光学显微镜观察等。
然而，荧光标记方法对光照条件和荧光物质的稳定性有一定要求，且荧光信号容易受到组织自身荧光的干扰。
2. 酶标记：酶标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，通过酶的催化作用来产生显色或荧光信号。
最常用的酶标记方法是辣根过氧化物酶（HRP）标记和碱性磷酸酶（AP）标记。
酶标记方法具有较高的灵敏度和稳定性，适用于免疫组化和免疫印迹等实验。
然而，酶标记对显色反应的条件要求严格，且显色或荧光信号不易于定量。
3. 放射性标记：放射性标记方法利用放射性同位素标记抗体，通过射线的衰变来检测目标分子。
放射性标记方法具有极高的灵敏度和定量性，适用于放射免疫测定等实验。
然而，放射性标记需要较复杂的实验操作和设备，同时存在一定的安全风险。
综上所述，选择适当的抗体标记方法应根据实验需求和目标分子的性质来决定，综合考虑灵敏度、特异性、稳定性、定量性和安全性等因素。
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
抗体标记技术的原理
抗体标记技术的原理
抗体标记技术是一种用于检测特定分子或细胞的方法，利用特异性抗体与目标分子或细胞结合，然后使用标记物来可视化或定量测量目标物体。
其原理包括以下几个步骤：
1. 选择特异性抗体：根据需要检测的目标分子或细胞，选择一种特异性抗体。
抗体是免疫系统产生的蛋白质分子，具有与其配体（目标分子或细胞）结合的特异性。
2. 标记抗体：抗体可以通过化学方法与标记物结合，常用的标记物有酶、荧光染料、放射性同位素等。
标记抗体允许我们可视化或定量测量目标物体。
3. 反应与冲洗：将标记抗体与样品中的目标分子或细胞反应，使抗体与目标物体结合。
待反应完成后，通过冲洗去除未结合的抗体，以减少非特异性背景。
4. 可视化或检测：根据不同的标记物，可以使用不同的方法来可视化或检测目标物体。
例如，如果使用酶标记抗体，可以加入底物使酶催化反应发生，产生可见的颜色或荧光信号。
如果使用荧光染料标记抗体，则可使用荧光显微镜观察。
抗体标记技术具有高度的特异性和敏感性，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
它可以用于检测特定蛋白质、细胞表面标志物、免疫反应等，并为研究者提供定量和定位分析的工具。
免疫标记技术总结
同上
Ag+（Ab1）要先加入待测B细胞及抗原刺激物，进行细胞培养，使其分泌Ab1
Ab-B：生物素标记的抗CK抗体
A-E：酶标链霉亲和素
发光酶免疫试验（LEIA）：
发光分析+免疫反应；
固相载体：磁微粒
化学发光酶免疫试验（CLEIA)
反应类型同ELISA
eg：双抗体夹心法
Ab+（Ag）+Ab-E→Ab-（Ag）-Ab-E+发光增强剂+S→Ab-（Ag）-Ab-E-发光增强剂-S+发光启动→鲁米诺发光
定量细胞因子分泌细胞
一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，
斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关
第一步Ab+（Ag）要先加入待测细胞及抗原刺激物，进行细胞培养，使其分泌CK（Ag）
Ab：抗CK抗体
（Ag）：CK
Ab-B：生物素标记的抗CK抗体
A-E：酶标链霉亲和素
间接法
Ag+（Ab1）→Ag-（Ab1）+Ab-B→Ag-（Ab1）-Ab-B+A-E→Ag-（Ab1）-Ab-B-A-E+S→显色
Ab（HBsAb，HIV-Ab）
一步法（常用），灵敏度、特异性高
关键在于酶标抗原的制备
间接法
Ag+（Ab1）→Ag-（Ab1）+Ab2-E→Ag-（Ab1）-Ab2-E+S→显色
最常用测Ab1（传染病的诊断或自身抗体）
高敏感性，只需应用一种酶标抗体（通用性）
固相抗原要求纯度高；大量非特异性IgG导致假阳性（稀释后再测）;保存不佳，使本底加深
Ab1：抗人μ链抗体（抗IgM抗体）
（Ab2）：IgM类抗体
抗体的标记——辣根过氧化物酶(HRP)32
抗体的标记修饰抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）、荧光染料（FITC、PE、APC等）、生物素（Biotin）、胶体金等。
一、抗体/蛋白的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法，先将HRP糖基氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应，抗体分子与HRP分子形成稳定结构。
标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记，此时,两者的质量约为1:1。
1. 抗体/蛋白的HRP标记（NaIO4氧化法）标记以2mg抗体为例。
1.1 抗体/蛋白的处理待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液(0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6) 中透析，其间换液2次，抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml；或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml，如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。
1.2 HRP酶的氧化1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。
1.2.2 称取NaIO4 21mg，溶于1 mL的ddH2O中，吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合，4℃下静置30min，此时溶液为绿色。
（注意：此后的操作均在避光条件下进行。
）1.2.3 吸取２µL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液，室温避光静置30min，此时溶液为褐色。
1.3 抗体的标记1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中，室温反应２h。
1.3.2 称取0.4mg的NaBH4，溶解于20µL的ddH2O中，全部加入上步反应液中，4℃静置2h，每30min摇动一次。
1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜，标记液中加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。
化学发光血栓四项抗体标记
化学发光血栓四项抗体标记引言：血栓形成是一种常见的疾病，可导致严重的血管阻塞，甚至危及生命。
为了检测血栓的形成和进展，医学界开发了一种新的技术——化学发光血栓四项抗体标记。
本文将介绍这项技术的原理、应用以及未来的发展前景。
一、原理：化学发光血栓四项抗体标记技术基于免疫学原理，利用特异性抗体与血栓相关的分子进行特异性结合。
这些抗体标记着血栓的形成和发展过程，通过化学发光的方式进行检测。
二、四项抗体的作用：1. 抗凝血因子抗体：血栓形成的过程中，凝血因子起着重要的作用。
抗凝血因子抗体可以识别并结合血栓中的凝血因子，从而阻止血栓的形成和扩展。
2. 血小板激活标记物抗体：血小板的激活是血栓形成的重要环节。
血小板激活标记物抗体可以识别并结合激活的血小板，帮助医生了解血栓的进展情况。
3. 血管内皮细胞损伤标记物抗体：血管内皮细胞损伤是血栓形成的触发因素之一。
血管内皮细胞损伤标记物抗体可以识别并结合受损的血管内皮细胞，提示血栓的形成风险。
4. 纤溶酶原激活物抗体：纤溶酶原激活物是纤溶系统中的重要因子，参与血栓的溶解过程。
纤溶酶原激活物抗体可以识别并结合纤溶酶原激活物，评估血栓溶解的效果。
三、应用：1. 临床诊断：化学发光血栓四项抗体标记可以用于血栓相关疾病的临床诊断，如深静脉血栓和肺栓塞等。
通过检测血栓相关标记物的水平，可以判断血栓形成的风险和血栓溶解的效果。
2. 疾病预测：血栓相关疾病的预测对于及时干预和治疗至关重要。
化学发光血栓四项抗体标记可以帮助医生预测疾病的发展趋势，早期发现并采取相应的预防措施。
3. 治疗指导：对于已经确诊的血栓相关疾病，化学发光血栓四项抗体标记可以帮助医生评估治疗的效果，并指导后续的治疗方案调整。
四、发展前景：化学发光血栓四项抗体标记技术在血栓相关疾病的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。
随着科技的不断进步，该技术的灵敏度和特异性将得到进一步提高，为患者提供更准确的诊断和治疗方案。
此外，结合人工智能和大数据分析，可以实现更精准的血栓风险预测，并为个体化治疗提供科学依据。
常见抗体标记技术之三：抗体的生物素化标记
常见抗体标记技术之三：抗体的生物素化标记基本原理本法可使抗体或其它蛋白质的e-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。
其后,生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。
小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础试剂及仪器NHSB:N-羟基琥珀酰亚胺生物素(有商品供应)0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液,pH8.0(见附录双蒸水(注意去除游离氨基),用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液DMS0(二甲亚砜,有毒试剂)叠氮钠(有毒试剂)10g/L牛血清白蛋白(W/W)PBS液分子筛柱电磁搅拌器透析袋(MWCO8000)铝铂微量移液器操作步骤1.将待生物素化的蛋白质用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6)稀释到1mg般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml2.交互用0.1mo1/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)或0.5mol/L硼酸缓冲液(pH8.6),对蛋白质充分透析3.用 1m1 DMS0溶解 NHSB Img4.向1m1蛋白质溶液(即含蛋白质1mg)加入120u1NHSB溶液(即含NHSB120g)5.在室温下持续搅拌,保温2-4小时6.加入9.6μL1mol/LNH41(每25μ g NHSB加1u1),在室温下搅拌10分钟7.在4℃,对PBS充分透析,以除去游离的生物素8.将样品上1ml的分子筛柱,以PBS缓慢洗脱,收集1ml/管,蛋白质在1-3m1之间洗下9.最后,样品加入叠氮钠(终浓度0.5g/L)及1.0g/LBSA。
将结合产物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置一20℃保存质量监测与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素( neutravidin),通过标准方法( Westerblotting或免疫荧光染色法)测定交联率实验要点及说明1.如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在,会抑制标记反应。
抗体荧光标记方法
抗体荧光标记方法1. 嘿，你知道直接标记法不？就像给抗体穿上一件闪闪发光的外套！比如说，把荧光染料直接连接到抗体上，哇哦，这样不就很直观地看到抗体啦！就像给小宠物戴上一个漂亮的铃铛，一下子就能找到它。
2. 还有间接标记法呢！这就好比接力赛呀。
先让一抗去结合目标，然后再用带荧光的二抗去结合一抗。
举个例子，就像先派个侦查员去找到目标，再让带着荧光信号的大部队去跟上，酷吧！3. 生物素-亲和素系统标记法也很厉害呀！就像搭积木一样，生物素和亲和素能紧密结合。
比如说在抗体上连上生物素，再和带荧光的亲和素结合，这多巧妙呀！4. 酶标抗体法也不容小觑哦！可以让酶去作用产生能发光的东西。
就好像是点燃了一个小烟花来引起注意，不是很有趣吗？比如用特定的酶让底物发光来指示抗体的位置。
5. 量子点标记法呢，那可是很神奇的哟！量子点就像一个个超级闪亮的小精灵。
比如用它们标记抗体后，那光芒简直耀眼，能非常清晰地显示出来。
6. 荧光蛋白标记法也很棒呀！不就跟让抗体带上了会发光的小彩灯一样嘛。
就像给抗体化了个闪亮的妆，一下子就变得与众不同啦，比如说用绿色荧光蛋白来标记。
7. 化学发光标记法也很好玩呀！虽然它不是直接发荧光，但能产生化学反应发光呢。
这就好像变魔术一样，突然就亮出光芒了，比如免疫反应后产生化学发光来指示抗体的存在。
8. 金标抗体法你可别小瞧呀！小小的金颗粒可是有大作用呢。
就如同给抗体配上了一个独特的标志，很容易被发现。
比如说金颗粒聚集后就能看到明显的信号啦。
我觉得这些抗体荧光标记方法都各有各的奇妙之处，根据不同的需求可以选择合适的方法，它们真的是科研中的好帮手呀！。
抗体标记技术的原理
抗体标记技术的原理抗体标记技术是一种广泛应用于生物学研究领域的技术，它利用抗体与特定的分子结合，通过标记物的荧光或酶活性等特性，实现对目标分子的检测和定位。
本文将从抗体选择、标记物选择、标记原理和应用领域四个方面介绍抗体标记技术的原理。
一、抗体选择在使用抗体标记技术之前，首先需要选择合适的抗体。
抗体是一种由免疫细胞产生的蛋白质，具有高度特异性，可以与特定的分子结合。
选择抗体时，需要考虑目标分子的性质、抗体的亲和性和特异性等因素。
常用的抗体来源有小鼠、兔子等，其中小鼠来源的抗体多用于体外实验，兔子来源的抗体多用于体内实验。
二、标记物选择标记物是指与抗体结合的物质，常用的标记物有荧光染料、酶和放射性同位素等。
选择标记物时，需要考虑其稳定性、检测灵敏度和对生物样品的影响等因素。
荧光染料是最常用的标记物之一，具有高度灵敏的检测能力和多色标记的优势。
酶标记则常用于酶联免疫吸附试验(ELISA)等领域，可以通过底物的酶促反应产生可见信号。
放射性同位素标记则常用于放射免疫分析(RIA)等领域，具有高度灵敏的检测能力。
三、标记原理抗体标记技术的原理是通过将标记物与抗体结合，实现对目标分子的检测和定位。
标记物可以与抗体结合在不同的位置，常见的有直接标记和间接标记两种方式。
直接标记是将标记物直接与抗体结合，常用的方法有共价键结合和非共价键结合。
共价键结合是将标记物与抗体中的氨基或羟基等官能团进行共价键结合，使标记物牢固地连接在抗体上。
非共价键结合则是通过亲和性或特异性结合，使标记物与抗体紧密结合。
间接标记是在抗体上结合一个可识别的中间体，再将标记物与中间体结合。
间接标记常用于多重标记和放射免疫分析等领域。
四、应用领域抗体标记技术广泛应用于生物学研究领域。
在细胞和组织学研究中，可以利用抗体标记技术对细胞器、蛋白质、核酸等进行定位和表达分析。
在免疫学研究中，可以利用抗体标记技术检测和鉴定特定的抗原和抗体。
在疾病诊断和治疗中，可以利用抗体标记技术对病原体、肿瘤细胞等进行检测和治疗。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
(3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml)，混匀。
(4)称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。
(5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403×0.4IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。
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第1章抗体分子标记技术第一节抗体的I125标记法基本原理有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。
当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。
蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。
在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。
该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。
试剂及仪器●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1)●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液●凝胶过滤柱●γ-记数器●100g/L 三氯醋酸●70% 乙醇●玻璃纤维滤●氯胺T (Chloramine T)反应用* 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）；* 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。
操作步骤*注意：125I 对健康有害，需要保护措施。
在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。
（一）氯胺T法1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；2．加500 μCi 的Na125I ，混匀；3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀；4．在室温下培养1分钟；5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）；6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。
将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。
应用γ-记数器监测各组分；7．收集、合并含碘化抗体的各管；8．将125I标记的抗体管放入同位素保护管中，置4℃保存。
（二）Iodogen-包被试管法1.Iodogen以0.5μg/ml溶于氯仿；2.将100μl Iodogen液移入合用的玻璃试管中；3.试管置通风橱中过夜，在室温下让氯仿蒸发；4.加入50μl 抗体（0.2-1mg/ml在pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液中）；5.加500 μCi Na125I 到加有抗体的Iodogen-包被管中，室温保温2分钟；6.将管中反应液转入1.5ml Eppendof 管（其中已先加有50μl Iodogen 反应终止缓冲液），轻混；7.通过凝胶过滤层析，将碘化抗体与碘化酪氨酸分离（同前络胺T法）；8.收集、混合含碘化抗体的各管；9.将125I标记的抗体置同位素保护管中，放4℃保存。
实验质量监测应用三氯醋酸沉淀法测定抗体标记效率：1．取两片玻璃纤维滤纸，用软铅笔写标记；2．将滤纸平放在试管架的孔部，使其中心部分不接触试管架；3．将1-5μl含约10000cpm 的样品，准确的点到每一张滤纸的中心，在室温下待干；4．用平头镊子将一滤纸转入试管，加入2ml 100g/L三氯醋酸；5．滤纸在三氯醋酸液中浸转10 分钟，倾出溶液；6．再加入2ml 100g/L 三氯醋酸，重复上述操作；7．加入2ml 70%乙醇，滤纸浸在乙醇中转动10 分钟后，倾出溶液；8．测定经过洗过涤与未洗涤滤纸的放射性；9．由所测定滤纸点样中与抗体结合的125I量，计算与抗体液中与抗体结合的125I总量。
洗后滤纸的cpm未洗滤纸的cpm × 100 = 结合碘的比率样品的总量/ 收集的分量×在洗后滤纸中的cpm = 总抗体-结合放射性*与抗体结合的同位素量应为样品中同位素总量的70-95%。
实验要点及说明1．用氯胺T法进行碘化，也可在大约pH 7.0的缓冲液中进行。
均必需保证反应体系中无还原剂存在。
2．如果氧化反应损伤蛋白质，可将氯抗体与异硫氰酸荧光素（ FITC）偶联）胺T量减少到0.02mg/ml, 并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml。
3．Iodogen-包被的试管可在干燥器中，室温下，保存多年。
4．125I标记的抗体，在制备后六周内均可使用（125I的半衰期为59.6天）。
5．要注意保证所用的Na125I是新鲜的，陈旧制剂的比活性低。
6．酪氨酸的碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰，因此降低其结合能力，但这种情况很少见。
* 以上同位素标记方法中需用高度纯化的抗体，以保证结果的可靠。
参考文献1．Fraker, PL .and Speck, JC (1978) Protein and cell membrane iodination with sparkingly soluble chloramines, 1，3，4，6-tetrachloro-3α,6α-diphenyl-glucoluril. Biochem. Biophys. Res. Commun.80,849-857.2．Greenwood, FC., Hunter, WM. And Glover, JS. (1963) The preparation of 125I-labeled human growth hormone of high specific radioactivity. J. Biochem. 89, 114-123.3．孙册，朱正美及顾天爵放射性标记凝集素《糖复合物生化研究技术》浙江大学出版社 1999 pp.501-504（朱正美）抗体的酶标记法基本原理本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。
即通过应用单、双或多功能基试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶－抗体偶联复合物。
不同的酶-抗体复合物制备方法中，最广泛应用的是第一步加入戊二醛的方法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。
试剂及仪器●亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸缓冲液 pH6.8）●用以标记的酶（EIA级，有商品供应）：辣根过氧化物酶( HRP,纯度为A430/A275 > 3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶（AKP），或大肠干菌β－D－半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。
●2５％戊二醛液（电镜级）●０.1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.8）●PBS ( 见附录 )● 2 mol/L 甘氨酸液●蒸溜甘油●透析袋（分子量6000-8000）●电磁搅拌器和搅拌棒操作步骤一．抗体与过氧化物酶偶联1．将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；2．在4℃对0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）透析过夜；3．用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）稀释戊二醛至1%；4．向透析混合液中加入50μl 稀释过的戊二醛，在室温下轻1轻搅拌三小时；5．加入2 mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1 mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基6．混合液在4℃对PBS透析过夜；7．10000 × g 4℃离心30分；8．将上清移入另一管中，按体积1：1加入甘油，使终浓度达50%；9．置-20℃保存。
二．抗体与AKP偶联1．将5mg抗体与10mg酶在总体积2ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；2．其它操作同HRP标记法。
三．抗体与葡萄糖氧化酶偶联按HRP偶联法操作，仅加入的1%戊二醛改为150 μl。
四．抗体与β－D－半乳糖苷酶偶联按HRP偶联法操作，但见偶联反应总体积改为2ml，１%戊二醛用量改为的100μl。
反应质量测定可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。
（具体方法见-----）实验要点及说明１．如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点，则在偶联反应中，被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏；２．主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在，游离氨基容易和戊二醛反应，因而干扰蛋白质的交连。
因此，必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液，并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析，是反应成功的要点。
３．反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。
参考文献１．Avrameas,S. (1969) Coupling of enzymes to protein with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibody. Immunochemistry 5, 43-52 ２．Avrameas,S. and Ternyck, T. (1971) Peroxidase labelled antibody and Fab congugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry. 8(12): 1175-1179（朱正美）第三节抗体的生物素化标记基本原理本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。
其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。
小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。
试剂及仪器●NHSB：N-羟基琥珀酰亚胺生物素（有商品供应）●0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0（见附录）●双蒸水（注意去除游离氨基），用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液●DMSO（二甲亚砜，有毒试剂）● 1 mol/L NH4Cl●叠氮钠（有毒试剂）●PBS（见附录）●10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液●分子筛柱（如G25）●电磁搅拌器●透析袋（MW CO 8000）●铝铂●微量移液器操作步骤１．将待生物素化的蛋白质用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/ml,一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml;２．交互用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6），对蛋白质充分透析；３．用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg；４．向1ml蛋白质溶液（即含蛋白质1mg）加入120μl NHSB溶液（即含NHSB 120 μg）；５．在室温下持续搅拌，保温2-4小时；６．加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl)，在室温下搅拌10分钟；７．在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；８．将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1-3ml之间洗下；９．最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.5g/L）及1.0g/L BSA。