荧光素标记抗体技术

荧光素标记抗体技术

(一)　原理
目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
(二)　操作步骤
将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
↓
称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)
使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
在10ml小烧杯中先放入抗体
↓
按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
↓
将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P
比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算:
2.87×A495
F／P＝────────
A280-0.35×A495
合适的F／P值为2～4。
(三)　试剂器材
1.　纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
3.　PBS、DMSO
4.　PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
5.　PD10柱(Sephadex G25柱)
6.　磁力搅拌器，紫外分光光度计等
(四)　注意事项
1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
2.　FITC-DMSO液要临用时配制。
3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。