抗体PE荧光素标记操作流程记录
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
免疫荧光染色实验记录模板
免疫荧光染色实验记录模板
1. 实验日期和实验者信息，记录实验进行的日期和实验人员的姓名或编号，以便追溯实验操作和结果的责任人。
2. 样本信息，包括样本来源、处理方法、处理时间和处理条件等信息。
确保记录样本的处理过程，以便在实验结果出现问题时进行排查。
3. 抗体信息，记录使用的抗体信息，包括抗体的来源、批号、稀释倍数、存储条件等。
这些信息对实验结果的准确性和可重复性非常重要。
4. 染色条件，记录染色的条件，包括染色液的配制方法、染色时间、温度等。
这些条件对实验结果的准确性和可重复性有重要影响。
5. 显微镜观察，记录观察到的样本荧光信号情况，包括荧光强度、分布情况等。
这些观察结果是实验结果的直接呈现，需要详细记录。
6. 图像记录，如果有条件，最好拍摄实验样本的荧光图像，并记录图像的拍摄条件和处理方法。
图像记录可以作为实验结果的直观呈现。
7. 结果分析，对实验结果进行简要分析和总结，包括样本的阳性率、荧光强度的定量分析等。
这些分析结果可以帮助理解实验结果的意义和可靠性。
以上是免疫荧光染色实验记录模板的基本内容，通过完整记录实验过程和结果，可以提高实验的可重复性和结果的可靠性，为科研工作提供有力支持。
免疫荧光直接标记抗体 使用方法
免疫荧光直接标记抗体使用方法
免疫荧光直接标记抗体是一种常用的实验技术，用于检测细胞
或组织中特定抗原的存在。
下面我将从准备实验所需材料、实验步
骤和注意事项等方面来全面回答你的问题。
首先，进行免疫荧光直接标记抗体实验需要准备一系列材料，
包括目标抗体、荧光染料标记剂、缓冲液、洗涤缓冲液、封闭剂、
载玻片或培养皿、显微镜等。
在实验开始前，需要将所有材料准备
妥当并确保实验环境清洁。
接下来，进行实验步骤。
首先，将目标抗体与荧光染料标记剂
按照厂家提供的建议比例混合，然后在适当的条件下反应一段时间。
接着，将标记后的抗体与待检样本（如细胞或组织切片）接触，让
抗体与目标抗原结合。
随后，用洗涤缓冲液洗涤样本，以去除未结
合的抗体。
最后，加入封闭剂进行封闭处理，然后进行显微镜观察
或其他检测方法，就可以观察到目标抗原的荧光信号了。
在进行免疫荧光直接标记抗体实验时，需要注意一些事项。
首先，要严格按照厂家提供的实验操作手册进行操作，确保实验操作
的准确性和可重复性。
其次，要注意实验中的所有试剂和样本的保
存和处理条件，避免对实验结果产生影响。
另外，在实验过程中要注意个人防护，避免接触有害物质或受到实验操作的伤害。
总的来说，免疫荧光直接标记抗体的使用方法是一个相对复杂的实验技术，需要熟练的操作和严格的实验条件控制。
通过合理的实验设计和操作，可以准确、快速地检测细胞或组织中特定抗原的存在，为科研工作提供重要的帮助。
希望以上回答能够全面地解答你的问题。
流式抗体标记步骤
1)细胞膜荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应15min。
③加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
④加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次。
⑤加入1mlPBS或者生理盐水重悬细胞，准备上样。
注意事项：●加入血样和抗体前，须注意编号和血样及抗体的一致性。
●实验室要注意冬天保温，夏天降温，防止室温过低或过高，影响抗原抗体反应。
●溶血时，溶血剂和血样的比例为50:1，当血样体积发生变化时，注意溶血剂体积的变化。
2)细胞膜kappa/lambda荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
③加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤三次④沉淀物中按上样管标记分别CD45-PE-CY5和kappa/lambda试剂盒和同型对照，避光反应15~30min⑤加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次⑥保留沉淀物种加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
注意事项：●沉淀物中的液体不能留太多，控制保留液体体积，保证抗体效价●溶血判断请参照细胞膜荧光抗体标记标准操作规程3)细胞内荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的包膜荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应10min。
③加入破膜剂试剂盒A液100ul剧烈震荡混匀，避光固定10min④加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑤沉淀物首先剧烈震荡混匀，然后小心加入破膜剂试剂盒B液100ul，不得震荡和剧烈摇晃，避光反应5min⑥加入上样管所标记对应的胞内荧光抗体，避光反应15min⑦加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑧重复步骤7两次，加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。
常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。
2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。
3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。
4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。
5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。
6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。
二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。
2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。
3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。
根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。
4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。
根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。
注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。
2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。
3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。
4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。
5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。
6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。
[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法荧光素FITC（Fluorescein Isothiocyanate）标记抗体是一种常用的免疫染色技术，在生命科学研究中广泛应用于细胞、组织和分子的可视化及定量分析。
荧光素FITC标记抗体的方法主要包括材料准备、抗体标记、纯化和检测等步骤。
材料准备：1. 荧光素FITC标记剂（Fluorescein Isothiocyanate）2.抗体样品（可购买或通过克隆等方法获取）3. Phosphate-buffered saline (PBS)缓冲液（pH 7.4）4.碳酸氢钠（NaHCO3）5.钠氢磷酸二水合物（Na2HPO4·2H2O）6.无水甲醇或二甲基亚砜（DMSO）抗体标记：1. 将所需量的荧光素FITC标记剂溶解在无水甲醇或DMSO中，得到FITC标记剂的浓度为1-10 mg/mL。
2.将抗体溶液与FITC标记剂按照一定的比例混合，通常比例为1:1到1:10，充分混合。
3.在充满PBS缓冲液的离心管中加入混合液，并在黑暗条件下，在4°C下孵育1-2小时或过夜，以进行反应。
纯化：1.将样品离心5分钟，以去除半固体物质。
2.用PBS缓冲液洗涤标记抗体1-2次，以去除未反应的FITC和其他杂质。
3.使用滤过设备，例如蛋白尺寸排除柱（如蛋白G纯化柱），将抗体从未反应的FITC和其他杂质中进一步纯化。
检测：1.使用荧光显微镜或流式细胞术检测标记抗体的荧光素FITC信号。
2.荧光显微镜：将样品涂盖在载玻片上，使用适当波长的激发光源照射并观察荧光信号。
3.流式细胞术：将标记抗体与细胞混合，通过流式细胞术仪器检测细胞中FITC的荧光信号。
1.可以在活体组织或细胞中进行实时或定量检测。
2.FITC标记抗体稳定性较好，可以在长时间照射下保持荧光信号不衰减。
3.FITC标记抗体荧光信号强度较高，检测灵敏度较好。
4.FITC标记抗体可以与其他标记的抗体同时使用，实现多重染色。
percp标记步骤
percp标记步骤
PerCP（Peridinin叶绿素蛋白复合物）是从Dinophyceae sp。
中分离出来的一种荧光染料，具有极高的灭绝系数、高的量子效率和大的斯托克斯位移。
在488 nm处被氩激光很好地激发，其最大发射峰在677nm处。
PerCP蛋白通常用于荧光免疫标记，特别是在涉及荧光激活细胞分选（FACS）的应用中。
其花青串联共轭物，如BD开发的PerCP-Cy5.5，可以用标准的488 nm激光激发，并以更长的波长发射远红色，用于细胞的多色流式细胞仪分析。
关于PerCP标记的步骤，虽然具体的步骤可能会因实验条件和目标而有所不同，但通常包括以下几个基本步骤：
准备样品：根据实验需求，准备好需要标记的细胞或蛋白质样品。
配制标记溶液：将PerCP染料按照适当的比例溶解在适当的溶剂中，制备成标记溶液。
这一步通常需要根据染料的说明书和实验需求进行调整。
标记：将样品与标记溶液混合，使染料与细胞或蛋白质结合。
这一步可能需要一定的时间，以便染料充分与样品结合。
洗涤：用适当的溶液洗涤标记后的样品，以去除未结合的染料。
分析：使用流式细胞仪或其他适当的设备分析标记后的样品。
这一步可以观察染料的荧光信号，从而了解细胞或蛋白质的特性。
需要注意的是，PerCP标记的具体步骤可能会因实验条件、目标以及所使用的染料类型而有所不同。
因此，在进行实验前，建议详细阅读染料的说明书，并遵循相关的实验指南和建议。
同时，也需要注意实验中的安全和环保问题，避免对环境和人体造成危害。
抗体APC荧光素标记操作流程记录学习资料
抗体A P C荧光素标记操作流程记录
1.目的
规范单克隆抗体标记荧光APC (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光APC (快速标记法）操作
3.术语和定义
别藻蓝蛋白（allophycocyanin ，APC ）由藻蓝胆素与蛋白质结合而成，APC具有荧光性，伴随着非常高的光吸收和高量子效率。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
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5.2其他试剂
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6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入 mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与APC反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg APC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
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四种抗体免疫荧光染色操作步骤
四种抗体免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色听起来就很厉害的样子呢，其实操作起来也没有特别难啦。
一、样本准备。
咱得先把要染色的样本处理好哦。
如果是细胞样本的话，要把细胞好好地培养在载玻片或者盖玻片上，让它们长得美美的，可不能有太多杂质或者状态不好。
要是组织样本呢，就得把组织切成薄片，这个切的时候可得小心啦，就像对待小宝贝一样。
二、固定。
固定这个步骤超重要的。
一般用多聚甲醛来固定样本，把样本泡在里面一段时间，就像给细胞或者组织来个“定身术”，让它们保持原来的样子，这样后面染色的时候才不会变形。
这个时间要掌握好哦，太久或者太短都不太好。
三、通透。
接下来就是通透啦。
用一些通透剂，像Triton X - 100之类的，让抗体能够顺利地进入细胞里面去找到它们要结合的目标。
这就像是给抗体开了个小通道，让它们能自由穿梭。
四、封闭。
封闭就像是给样本穿上一层保护衣。
用正常血清或者牛血清白蛋白之类的东西把样本上那些非特异性结合的位点给占住，这样抗体就不会乱结合啦，只会乖乖地去找自己的目标。
五、一抗孵育。
现在轮到一抗上场啦。
把我们准备好的四种抗体按照合适的比例稀释好，然后加到样本上。
这个时候样本就像是一个小舞台，一抗们就开始在上面寻找自己的舞伴（抗原）啦。
孵育的时间也要注意，要让它们有足够的时间去结合。
六、洗涤。
一抗孵育完了，就得把没结合上的一抗给洗掉，就像打扫舞台一样，只留下那些成功结合的一抗。
用缓冲液轻轻冲洗样本，多洗几次，这样才能保证后面的结果准确。
七、二抗孵育。
二抗是带着荧光标记的哦。
把二抗按照比例稀释后加到样本上，二抗就会去找一抗，然后紧紧地抱住它。
这时候就像给一抗穿上了一件会发光的衣服，超酷的。
八、再次洗涤。
和之前一样，把多余的二抗给洗掉，让舞台又变得干干净净的。
九、封片。
最后一步就是封片啦。
用封片剂把样本封起来，这样样本就可以好好保存，等着我们去观察它在荧光显微镜下的美丽模样啦。
免疫荧光染色就这么一步步来，每一步都很关键，就像搭积木一样，少了一块都不行呢。
荧光标记抗人抗体的检测(流式细胞术——直接法)标准操作规程
天津三箭生物技术有限公司（Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.）天津经济技术开发区第四大街80号天大科技园C5-106/311 邮编：300457Room106/311,Building C5,80 Fourth Avenue,TEDA Tianjin,PR,China. Zip:300457Tel ：0086-22-66211636， Fax ：0086-22-66211638Website ：荧光标记抗人抗体的检测（流式细胞术——细胞表面抗原染色——直接法）标准操作规程1、检验目的用于体外定性,定量的免疫分析，用来检测被检荧光标记抗体的特异性，荧光强度并确定所检抗体的滴度试验。
2、原理利用流式细胞技术检测荧光标记抗体。
根据抗原抗体结合原理，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。
经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性，定量分析。
3、实验材料人外周血若干ml试剂：1xPBS pH7.2；FACS TM Lysing Solution （BD Cat# 349202）；荧光素标记抗体；屈臣氏蒸馏水；NaClO耗材：抽血针头，5ml 抗凝抽血管，流式管,离心管，离心管架； 移液器（10ul ，20ul ，100ul ，200ul ，1000ul 及5ml ）； 100*100冻存盒；泡沫盒等。
仪器：低速离心机，制冰机，流式细胞仪4、实验步骤（1）单细胞悬液的制备1）根据试验需要取人外周血若干ml 待用。
（2）染色1）根据试验设计，标记好流式管号。
2）用移液器取100μl 细胞/管（约106细胞），分别加到已经标记好的流式管底部（不可粘到管壁）。
3）根据试验设计，向流式管中加入相应荧光素标记抗体。
混匀。
4）冰上（或4度冰箱）避光染色30min 。
5）加入2ml 1x FACS TM Lysing Solution ，混匀后裂解10min,1400 rpm/min ，离心5min 。
抗体PE荧光素标记操作流程记录
抗体PE荧光素标记操作流程记录一、实验准备1.1准备工具和试剂：-PE荧光素标记试剂盒（内含PE荧光素和可标记的抗体）-离心管和离心机-蛋白质浓度测定试剂盒-0.01MPBS缓冲液-冷冻干燥机-漩涡振荡器-稀释液（例如BSA或牛血清白蛋白）-显微镜玻璃片和盖玻片1.2样品准备：-准备需要标记的抗体- 确保抗体的浓度在2-5 mg/mL范围内-如果抗体浓度较低，可以进行浓缩处理以提高标记效率-在0.01MPBS缓冲液中稀释抗体至所需浓度二、抗体标记2.1将所需PE荧光素标记试剂盒中的PE荧光素固体完全溶解在10mL 的0.01MPBS缓冲液中2.2取出相应量的标记试剂液至一个离心管中，根据需要调整标记试剂的量，一般建议在1-10倍抗体量的范围内进行标记2.3将标记试剂液加入抗体溶液中，同时进行漩涡振荡混合2.4在室温下孵育标记混合物，时间一般为1-2小时，可以根据需要进行调整2.5在孵育过程中，建议定时轻轻漩涡振荡混合混合物，以确保充分的标记反应三、纯化标记抗体3.1使用离心机将标记混合物离心10分钟，以除去未反应的标记试剂和杂质3.2移除上清液，确保将尽量多的小颗粒留在离心管中3.3向离心管中加入2mL冷PBS缓冲液并混合悬浮液3.4使用离心机将离心管离心5分钟，并移除上清液3.5重复此步骤一次以确保完全去除未反应的标记试剂四、测定纯化后的标记抗体浓度4.1在蛋白质浓度测定试剂盒提供的说明书下，按照指示操作以测定抗体浓度4.2 确保标记抗体浓度在5-10 mg/mL范围内五、保存和储存标记抗体5.1将标记抗体分装至0.5-1mL的离心管中5.2加入10%-20%甘油作为稳定剂，以防止抗体降解和凝集5.3在-20°C以下的冷冻干燥机中冻干标记抗体样品5.4将冻干的标记抗体样品存放在-20°C以下的冰箱中六、实验操作注意事项-实验过程中需要严格遵循无菌操作规范，以防止抗体受到污染-根据实验需要，可以调整抗体和标记试剂的浓度以及反应时间，但需确保最终的标记抗体浓度在有效范围内-尽量避免标记试剂和抗体的过度稀释，以提高标记效率-实验完成后，将实验器材和废液进行正确的处理，以确保实验室环境的安全和清洁以上是抗体PE荧光素标记操作流程的记录，该流程涵盖了实验准备、抗体标记、纯化标记抗体、测定标记抗体浓度以及保存和储存标记抗体的步骤。
免疫荧光标记的方案
免疫荧光标记的方案一、实验前准备。
1. 材料收集。
首先呢，我们得把主角细胞或者组织样本准备好。
如果是细胞，就像呵护小宝贝一样，把培养的细胞从培养箱里温柔地取出来。
要是组织的话，就像对待珍贵的宝藏，小心地把组织切好，大小要合适，大概像小指甲盖那么大就行啦。
然后就是我们的荧光标记抗体，这可是这场派对的“魔法颜料”。
要根据我们想要标记的目标蛋白，从那些装满各种抗体的小瓶子里精挑细选出来。
还有固定液、通透液、封闭液这些小助手，一个都不能少。
2. 器材准备。
拿出干净的载玻片或者盖玻片，就像给小客人准备干净的座位一样。
还有多聚赖氨酸处理过的玻片，如果是细胞样本，这就像给细胞铺上了柔软的小毯子，让它们能舒舒服服地待着。
准备好微量移液器，这可是我们精确操作的小神器，就像小滴管一样，但是超级精准。
还有湿盒，这就像给样本打造的一个小小的“保湿房”，能让样本在实验过程中不会干巴巴的。
二、样本处理。
1. 固定。
如果是细胞，我们轻轻地把细胞培养液吸掉，就像给细胞洗个小澡，然后加入适量的固定液。
固定液就像给细胞拍了一张瞬间的照片，让它们保持住现在的模样。
一般用4%的多聚甲醛固定个15 30分钟就好啦。
对于组织样本呢，把切好的组织块放到固定液里浸泡，时间可以稍微长一点，大概30 60分钟。
2. 通透。
固定完了之后，细胞或者组织就像穿上了一层硬壳，这时候我们要用通透液来给它们开一些小通道，这样抗体才能进去找到目标蛋白。
对于细胞，用0.1% 0.5%的Triton X 100处理10 15分钟就可以啦。
组织的话，处理时间可能要稍微长一点，大概15 20分钟。
3. 封闭。
通透之后，样本表面就像有很多小坑坑洼洼，可能会吸引一些不必要的东西。
这时候我们要用封闭液来把这些小坑填满。
一般用5%的BSA（牛血清白蛋白）或者10%的正常血清，在室温下封闭30 60分钟。
这就像给样本穿上了一件防护服，只让我们想要的抗体进去。
三、免疫荧光标记。
1. 一抗孵育。
抗体PE荧光素标记操作流程记录
1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
用荧光抗体技术检测流程
用荧光抗体技术检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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荧光素标记抗体的方法
荧光素标记抗体的方法（一）FITC标记抗体的方法1．Marsshall 氏法（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。
（2）方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。
②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg 荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。
结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。
④透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液离心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，装入透析袋中后再置于烧杯中，用pH8.0缓冲盐水透析（0～4℃）过夜。
⑤过柱：取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定洗脱液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）;过滤量:12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析);收集量:20ml(稀释1.7倍)。
分别以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。
一半保留于2℃下，另一半置25℃下。
间隔一定时间后各取出0.5ml通过sephadex G-25去游离FITC，由上计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。
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1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。