最新1抗体标记

1抗体标记
抗体的纯化原理、方法
❖ 抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏 水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进 行分离、纯化
❖ 根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法 ❖ 标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化
❖ 抗体标记技术是指用荧光素、放射性核素、酶、胶 体金、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪 物标记抗体进行的抗原、抗体反应，并借助于荧光 显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和 发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观 察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微 结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定 位研究或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液 中的半抗原、抗原进行定性和定量测定
❖ 荧光：一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引 起发光，停止能量供给则发光瞬即停止
❖ 荧光素：是机化合物
❖ 要求：具备能与蛋白质分子形成稳定的共价键结合 的化学基团，荧光效率高 标记抗体后不影响抗原抗体的结合反应 标记方法简便 游离的荧光素易与标记后的抗体分离
❖ 改良法：稀释抗体至10mg/ml，降温至4℃ 加入FITC（抗体蛋白：FITC＝50～
80mg:1mg），4℃搅拌12～14h 用半饱和硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，
再用0.01MPBS透析 将制备好的荧光抗体加0.01％叠氮钠，分
装保存
❖ 透析标记法： pH9～9.5，抗体蛋白含量10～40 mg/ml 1)用0.05M pH9～9.5的碳酸缓冲液制备浓度为1mg/ ml的 FITC溶液 2)将10mg/ml抗体溶液对碳酸缓冲液透析过夜 3)搅拌，缓慢滴加一定体积的FITC溶液（抗体: FITC＝ 100:1），若pH低于9，用NaOH调节 4)室温，避光搅拌2～4h；将标记液用PBS溶液透析4～8h 5)以Sephadex G-25层析柱提纯标记物，除去过量FITC，置 于4℃保存
❖ 氯胺T法：
原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯 酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子， 使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少 量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射 性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成 带有放射性的化合物
优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得
酶标记技术
❖ 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶 标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色 的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有 色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查， 也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存 在，从而证明了发生了相应的免疫反应
❖ 常用于标记的酶： 辣根过氧化物酶(HRP)：由主酶和辅基结合而成的 过氧化物酶，能催化过氧化物（H2O2）对某些物质 的氧化，释放出的氧将无色的供氢体(OPD,TMB)氧 化成有色的产物 碱性磷酸酶（AKP）：作用于底物，形成磷酰基-酶 的中间产物，再进一步将磷酰基转变为无机磷
❖ 间接法：用4℃的PBS将抗体稀释至30～40mg/ml， 置于三角瓶中，放于冰槽中 按0.01mg荧光素/mg蛋白称取荧光素，用3 ％重碳酸钠水溶液溶解 抗体与荧光素等量混合，4 ℃结合18～24h 离心，除去少量沉淀物装入透析袋中，用 0.01M PBS透析，4℃过夜 用Sephadex G-25或50过滤，分离游离荧光 素，收集标记的荧光抗体
❖ 特异性强、灵敏度高、重复性强、样品及试剂用量 少、测定方法易规范化和自动化
❖ 可利用其衰变时放出的放射线进行测量，测量较 灵敏而方便
❖ H3,C14,I131,I125 ❖ H3,C14：不改变抗原的结构及其免疫学活性，标
记的抗体可长期使用，标记繁琐，测定麻烦 ❖ 方法：氯胺T碘化法和Indogen包被法
❖ 常用于标记抗体的荧光素：异硫氰酸荧光素 （FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明、四乙基罗丹明
❖ FITC标记方法：直接标记法、间接标记法、改良法 直接法：稀释抗体至20mg/ml，电磁搅拌5～10分钟
称取荧光素0.01mg荧光素/mg蛋白 将荧光素加入稀释抗体中，5～10分钟加完 搅拌12～18h，离心，除去少量沉淀物装入 透析袋中，用0.01M PBS透析，4℃过夜 用Sephadex G-25或50过滤，分离游离荧光 素，收集标记的荧光抗体
抗体的标记
❖ 放射性同位素标记 ❖ 荧光素色素标记 ❖ 酶标记 ❖ 生物素标记 ❖ 胶体金标记
荧光素色素标记技术
❖ 基本原理：将抗原、抗体反应的特异性和敏感性与 显微示踪的精确性相结合，以荧光素作为标记物与 已知的抗体结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原 结合的能力，然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原，在荧光灯源紫外 线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显 微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定 性、定位或定量的检测
❖ 戊二醛（GA）交联法：GA是一种双功能基团 试剂，通过醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨 基共价结合，形成酶-GA-免疫球蛋白结合物， 适用AKP
❖ 步骤：在细胞冻存管内加入纯化的100μg/100 μL McAb，再加入10 μL0.05MPBS，再加入10 μL I125 加入10 μL 氯胺T，迅速振荡，室温下反应40s 加入100 μL 还原剂偏重亚硫酸钠 加入200 μL KI溶液 将碘化反应混合液注入PD10柱，洗脱
❖ 保存：加入1/8体积的异丙醇，分装，置于铅罐重-20 储存备用，避免反复冻融
❖ 荧光抗体的鉴定：特异性和敏感性鉴定 ❖ 荧光抗体的保存：4℃或-20℃低温保存，最好
加入1:5000~10000的柳硫汞或1:1000~5000的 叠氮钠，分装，真空干燥更易长期保存
放射性同位素标记技术
❖ 将被标记物分子中某个原子或几个原子被放射性同 位素取代形成同位素标记化合物，是将同位素分析 的高灵敏度于与抗原-抗体反应的特异性相结合， 以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法