蛋白质酶抗体标记.ppt
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抗体的标记医学知识培训课件
抗体的标记医学知识
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AE特性
化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。 极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期 长达1 年甚至更久。 发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内 完成。
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电化学发光剂
是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点：①反应在电极进行；
衰变过程中释放γ射线，可用γ计数器测量，方法简便， 易推广应用；
半衰期(60天)适中、核素丰度(>95％)及计数率相对较高。
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二、荧光物质
有机化合物荧光素 稀土离子螯合物 荧光底物（酶作用后产生荧光的物质）
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荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）
抗体的标记医学知识
目录
第一节 标记物种类及特性 第二节 常见交联剂的种类及特性 第三节 放射性核素与抗原抗体结合物制备 第四节 荧光素与抗原抗体结合物制备 第五节 酶与抗原抗体结合物制备 第六节 化学发光剂与抗原抗体的结合物制备 第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备 第八节 量子点与抗原抗体的结合物制备 第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备
HO
H2O2 HRP
HO
CH 2 COOH CH 2 COOH
+荧 光
氧化二聚体
抗体的标记医学知识
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ALP底物
常用的ALP色原底物 对-硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP） 氯化硝基四氮唑蓝/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（ nitro- blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate，BCIP/ NBT） 4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferyl phosphate，4-MUP）是ALP的发光底物之一。
《抗体标记》PPT课件
❖ 保存：加入1/8体积的异丙醇，分装，置于铅罐重-20 储存备用，避免反复冻融来自精选PPT21
酶标记技术
❖ 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶 标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色 的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有 色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查， 也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存 在，从而证明了发生了相应的免疫反应
❖ 在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体 金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物
❖ pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗 粒的负电荷相互排斥而不能互相结合
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29
❖ 透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质 ❖ 去除蛋白质中的沉淀：离心 ❖ 标记：用K2CO3或HCl调节金溶液至所需pH
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19
❖ 氯胺T法：
原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯 酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子， 使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少 量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射 性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成 带有放射性的化合物
优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得
第十五讲 抗体的标记
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1
抗体的纯化原理、方法
❖ 抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏 水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进 行分离、纯化
❖ 根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法 ❖ 标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化
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2
抗体的预处理
❖ 过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒 ❖ 低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血
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酶标记技术
❖ 通过共价键经适当方法将酶联结在抗体上，制成酶 标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色 的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有 色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观查， 也可以用分光光度计测定，呈色反应显示了酶的存 在，从而证明了发生了相应的免疫反应
❖ 在低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体 金带负电荷，两者极易静电结合形成大的聚合物
❖ pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗 粒的负电荷相互排斥而不能互相结合
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❖ 透析除盐：除去蛋白质中多余的电解质 ❖ 去除蛋白质中的沉淀：离心 ❖ 标记：用K2CO3或HCl调节金溶液至所需pH
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❖ 氯胺T法：
原理：氯胺T是一种氧化剂，在水溶液重产生次氯 酸，可使带有负电荷的放射性碘离子氧化成碘分子， 使产生的自由碘分子与蛋白质中的酪氨酸残基（少 量的组氨酸残基）发生卤化反应使之成为含有放射 性碘化酪氨酸的多肽链，然后和被测物反应，生成 带有放射性的化合物
优点：标记效率高，重复性好，试剂便宜易得
第十五讲 抗体的标记
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1
抗体的纯化原理、方法
❖ 抗体分子有一定的等电点、溶解度、核电性及疏 水性，可以用电泳、盐析沉淀或其他层析技术进 行分离、纯化
❖ 根据抗体的用途和来源，确定具体的纯化方法 ❖ 标记抗体选择特异性好的亲和柱进行纯化
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2
抗体的预处理
❖ 过滤：去除脂质颗粒、纤维蛋白和固体颗粒 ❖ 低速离心：去除细胞残渣及小颗粒物质，适用于 血
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ELISA培训ppt课件
充分结合； 4）孵育温度不适合。 ——应保证抗体在最适宜并且稳定的温度下孵育，一般是室温（25℃
孵育2h或37℃孵育1h）。
18
影响因素的分析
1.标本的影响 1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中
含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难 以溶完性全 的洗有脱色，物它质可，使即H显2O蓝2释色放，出产原生生假态阳氧性(。O)所，以从严而重催溶化血底标物本四禁甲用基。联苯胺生成可 1.2 标本受细菌污染 ：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污 染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 1.3 标本保存不当 ：在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过 深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能 立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存 ；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混 匀时应轻柔，不可强烈振荡。
不絮的进行。
第二：实验准备 1.实验所使用物料的清点； 2.实验试剂的配备； 3.实验仪器的预约；
11
第三：实验操作（以双抗体夹心法为例）
1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小 时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次；
2.封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2 小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次；
22
Elisa的应用
ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
孵育2h或37℃孵育1h）。
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影响因素的分析
1.标本的影响 1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中
含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难 以溶完性全 的洗有脱色，物它质可，使即H显2O蓝2释色放，出产原生生假态阳氧性(。O)所，以从严而重催溶化血底标物本四禁甲用基。联苯胺生成可 1.2 标本受细菌污染 ：因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污 染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 1.3 标本保存不当 ：在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过 深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能 立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存 ；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混 匀时应轻柔，不可强烈振荡。
不絮的进行。
第二：实验准备 1.实验所使用物料的清点； 2.实验试剂的配备； 3.实验仪器的预约；
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第三：实验操作（以双抗体夹心法为例）
1.包被（在聚苯乙烯板上包被特异性已知抗体，使之与板结合） 4℃过夜（大于12小 时）或37℃孵育2小时，包被后洗涤一次；
2.封闭（一般使用0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清等）37℃反应2 小时（封闭液体积要大于包被液体积），封闭后清洗3次；
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Elisa的应用
ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
蛋白质和酶专题.ppt
酶的本质是蛋白质，凡是影响蛋白质 生物学活性的因素都能影响酶的活性。
第三节 酶的作用机制及调节
( Mechanism and Adjustment of Enzyme-Catalyzed Reaction)
一、酶的活性中心(active center)
活性中心或称活性部位(active site)，指 必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有 特定空间结构的区域，能与底物特异结合并 将底物转化为产物。
2. 催量单位 １催量(kat)是指在特定条件下，每 秒钟使１mol底物转化为产物所需的酶量。
3. kat与IU的换算： 1 IU=16.67×10-9 kat
第二节 酶催化作用的特点
(The Characteristic of Enzyme-Catalyzed Reaction)
酶与一般催化剂的共同点是：在反应前 后没有质和量的变化；只能催化热力学允许 的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而 不改变反应的平衡点。
存在自然界中的氨基酸有300余种，但组 成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L氨基酸（甘氨酸除外）。
氨基酸的结构特点
COO-
CHRH3
C +NH3
H
R-侧链基团
L-氨基酸的丙甘通氨氨式酸酸
O
NH2-CH-C +
H OH
甘氨酸
O NH-CH-C
H H OH
甘氨酸
-HOH
O
O
NH2-CH-C-N-CH-C
4、复性
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素 后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能，称为复性(renaturation) 。
蛋白质与医学的关系
由于各种原因（物理、化学、生物→基因突变等）导 致的蛋白质分子在结构或合成量上产生异常，从而引起机 体一系列病理改变，并产生功能障碍，从而引发某些疾病 产生。如血红蛋白病（镰形细胞贫血症、地中海贫血症）、 血浆蛋白病（血友病）、受体病（家族性高胆固醇血症）、 结构蛋白缺陷病（假肥大型营养不良）、膜转运蛋白病 （肝豆状核变性）等分子病。
第三节 酶的作用机制及调节
( Mechanism and Adjustment of Enzyme-Catalyzed Reaction)
一、酶的活性中心(active center)
活性中心或称活性部位(active site)，指 必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有 特定空间结构的区域，能与底物特异结合并 将底物转化为产物。
2. 催量单位 １催量(kat)是指在特定条件下，每 秒钟使１mol底物转化为产物所需的酶量。
3. kat与IU的换算： 1 IU=16.67×10-9 kat
第二节 酶催化作用的特点
(The Characteristic of Enzyme-Catalyzed Reaction)
酶与一般催化剂的共同点是：在反应前 后没有质和量的变化；只能催化热力学允许 的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而 不改变反应的平衡点。
存在自然界中的氨基酸有300余种，但组 成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L氨基酸（甘氨酸除外）。
氨基酸的结构特点
COO-
CHRH3
C +NH3
H
R-侧链基团
L-氨基酸的丙甘通氨氨式酸酸
O
NH2-CH-C +
H OH
甘氨酸
O NH-CH-C
H H OH
甘氨酸
-HOH
O
O
NH2-CH-C-N-CH-C
4、复性
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素 后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构 象和功能，称为复性(renaturation) 。
蛋白质与医学的关系
由于各种原因（物理、化学、生物→基因突变等）导 致的蛋白质分子在结构或合成量上产生异常，从而引起机 体一系列病理改变，并产生功能障碍，从而引发某些疾病 产生。如血红蛋白病（镰形细胞贫血症、地中海贫血症）、 血浆蛋白病（血友病）、受体病（家族性高胆固醇血症）、 结构蛋白缺陷病（假肥大型营养不良）、膜转运蛋白病 （肝豆状核变性）等分子病。
第十一章抗体酶ppt课件
3、定量分析
酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay ELISA） 将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗 原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复 合物专一且定量的结合关系，通过测定待测抗体（或抗原） 结合的标记酶活力，从而计算出抗原或抗体的量。
原分子被有目的地改造成某种反应的转换态中间物。
二、抗体酶的催化特征
1、与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应 有更强的专一性和稳定性 催化作用机制不同
2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性 反应的可逆性 反应的量效性 反应过程
三、抗体酶的催化作用机理
酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障
七、研究展望
1、研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系 的一般规律。
2、获得一类新型的蛋白酶。 3、催化天然酶不能催化的反应。
游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核 性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或 亲电反应而选择性修饰的特点。
4 . 引入辅助因子法
很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引 入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。
他们用三乙酸胺盐作为金属离子辅因子，所用的半抗原分子带 有一肽键；通过羧根及仲胺基与金属离子相连；将此半抗原通过共 价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体上，在金属离子复合物作 为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间 的肽键 。
第十一章 抗体酶（Abzyme)
蛋白质类：天然酶 enzyme
极端酶 extremozyme
生物催化剂
抗体酶 abzyme 生物工程酶
酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay ELISA） 将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗 原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复 合物专一且定量的结合关系，通过测定待测抗体（或抗原） 结合的标记酶活力，从而计算出抗原或抗体的量。
原分子被有目的地改造成某种反应的转换态中间物。
二、抗体酶的催化特征
1、与天然酶相比抗体酶的特点 能催化一些天然酶不能催化的反应 有更强的专一性和稳定性 催化作用机制不同
2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较 更高的反应特异性 反应的可逆性 反应的量效性 反应过程
三、抗体酶的催化作用机理
酶与底物形成过渡态理论 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障
七、研究展望
1、研究酶作用机理，获得蛋白质结构与功能间关系 的一般规律。
2、获得一类新型的蛋白酶。 3、催化天然酶不能催化的反应。
游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核 性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反应或 亲电反应而选择性修饰的特点。
4 . 引入辅助因子法
很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner等将金属离子引 入抗体酶，成功地催化了肽键的选择性水解。
他们用三乙酸胺盐作为金属离子辅因子，所用的半抗原分子带 有一肽键；通过羧根及仲胺基与金属离子相连；将此半抗原通过共 价键连接在载体蛋白免疫动物产生的抗体上，在金属离子复合物作 为辅因子的参与下，这些抗体酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之间 的肽键 。
第十一章 抗体酶（Abzyme)
蛋白质类：天然酶 enzyme
极端酶 extremozyme
生物催化剂
抗体酶 abzyme 生物工程酶
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角 剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从 膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液 中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在 滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小 心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶 舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿 的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源 进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电 转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰 染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干 滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
.
1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
蛋白质检测方法ppt课件
移 (photo-induced electron transfer PET）, 分子内电荷转移
( Intramolecular charge transfer , ICT)等效应对蛋白质进行选
择性识别
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精品课件
✓ 基于自组装机理检测蛋白质
超分子化学：分子聚集体结构和功能为研究对象, 旨在 研究分子基于弱相互作用的组装、自组装和自组织行为,并 研究这些行为可能带来的结构和功能的改变,以期建立结构 和功能之间的关系。超分子的组装的实现依赖于分子间键. 它包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位 键、π-π堆积作用等
曙红Y
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铬天青S
精品课件
溴酚蓝
Evans blue
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四羧基苯基卟啉
精品课件
偶氮染料
方酸菁染料
酞菁染料
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精品课件
✓ 基于AIE机理检测蛋白质
✓ 此外，小分子荧光探针还可基于荧光能量共振转移
(fluorescence resonance energy transfer, FRET),光诱导电子转
17
精品课件
近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。
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精品课件
比色法-BCA法
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第十一章 标 记
标记的概念
指以共价键的方式将放射性元素（如3H、 14C、32P、35S、125I）或非放射性物质（如地 高辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命 物质（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原 及某些小分子物质）上的过程
标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫 分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质 的定性、定量
由示踪物和被标记物构成的复合物称为探 针或某物的标记物
第一节 核 酸 标 记
核酸标记是指能与特定核酸序列（靶序列）发生特 异性互补（杂交），并含示踪物的已知核酸片段（DNA 或RNA）
一、标记物的制备及类型
(一)制备方法 ➢ 20C，70Y 磷酸化法 切口平移法 广泛用于分子克隆过程； 缺点： ①只能在核酸的5’端引进一个放射性原子，会限制探针的比活度
2.单链DNA探针制备
单链DNA探针的优点
不存在互补双链，避免了DNA双链在重新复性时形成 无效杂交体的可能性
方法 ①合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的DNA片段， 并以其作为模板合成与其互补的探针（为DNA） ②将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于DNA的 RNA-pol识别的启动子）上的靶序列转录成RNA探针； 再在反转录酶的催化作用下制备cDNA探针 方法①需分离探针和未标记的核酸，而方法②只需 用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的 体外转录法是合成单链DNA探针的较好方法
此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDN探针
（三）两种新标记法
扫若仑标记和分子灯塔探针
1.扫若仑标记
扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有 胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、 PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可 达fg级别）
②探针含有模板DNA双链序列片段，在某些情况下，探针的互 补链会竞争靶DNA与探针的结合
➢ 20C，80Y中期
体外转录RNA探针法 此法合成效率高，不需分离模板DNA， 但 应避免RNase污染
(二)核酸标记类型
➢(同位素)核素标记 通常采用的同位素有32P、33P、35S，其 中32P活性强，信号比较好
但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以 在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）“预杂 交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如 P201“b”）
（3）5’端-寡核苷酸探针
在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷 酸盐法，使5’端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷 酸与DIG反应制成标记于5’端的寡核苷酸探针
放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂 交的探针，再通过X-射线衍射和放射自显影检测分析结果 （但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）
➢非同位素标记 以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示 踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相 仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）
（二）生物素
用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物 素能与链霉菌亲和素（或称链霉菌白蛋白）- 酶直接结合， 亲和素与生物素的结合力强（结合常数 Ka 1015 ）；这类 蛋白质有4个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的 生物素结合，又可以与探针中的生物素结合
1.切口平移法制备生物素酰化的探针
试剂及操作（课本）
②切口平移法
原理：当双链DNA分子的一条链有切口时，E.coli-DNApolⅠ可将核苷酸残基（如Dig-11-dUTP）加到切口处的 3’-OH端；又由于该酶具有5’→3’外切酶活性，所以它可从 切口的5’端除去核苷酸。5’端除去和3’端加入核苷酸同时进 行，导致切口沿着DNA模板链移动
4.寡核苷酸探针的制备
用DIG-11-ddUTP制备寡核苷酸探针，制备出来 的探针有3’端-、5’端-寡核苷酸标记和3’-端尾部寡 核苷酸标记之分
（1）3’端-寡核苷酸探针
（2）3’-端尾部寡核苷酸探针
在寡核苷酸3’-端加上10~100个碱基的尾巴。可提高 探针的灵敏度
在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡 核苷酸的3’-尾端
1.双链DNA探针标记 ①随机引物介导法 ➢随机引物：不均一的寡核苷酸混合物（6~12核苷酸单链DNA） ➢模板：单链DNA ➢酶：DNA-pol（klenow片段） ➢合成原料： dNTP混合物 ➢标记物：Dig-dUTP ➢其他试剂
随机引物介导法是将线性DNA模板上多处与随机引物 杂交，在DNA-pol的 催化作用下，新链中掺入DIG-dUTP, 从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）
3.PCR合成DNA探针
第一次循环之前于95℃变性7min，随后每次循环的条 件是： 95℃变性45s，60℃退火1min,72 ℃延伸2min（一 个循环）
用PCR法制备的DIG探针灵敏度高（即使含有很少量的 副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前， 要用凝胶电泳纯化探针） ，数量大
扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外 光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面 形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和 RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若 仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量 成正比关系
5.RNA探针的制备
采用体外转录法制备
①先克隆合适的模板DNA到相应的转录载体（如噬菌体）
②将得到的重组DNA线性化
③RNA-pol催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始转 录，并将修饰的核苷酸（如DIG-UTP）掺入到RNA链中，从 而获得具有一定长度和较高活性的RNA探针（每20~25个核 苷酸可结合一个DIG-11-UTP）
二、非核素标记
生物素、地高辛等非放射性示踪物都很容易掺入到 DNA或RNA中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或 用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检 测
此法标记量足（一次反应可标记数mg），稳定性 好（有效期可达2年）
（一）地高辛（DIG）
标记的概念
指以共价键的方式将放射性元素（如3H、 14C、32P、35S、125I）或非放射性物质（如地 高辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命 物质（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原 及某些小分子物质）上的过程
标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫 分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质 的定性、定量
由示踪物和被标记物构成的复合物称为探 针或某物的标记物
第一节 核 酸 标 记
核酸标记是指能与特定核酸序列（靶序列）发生特 异性互补（杂交），并含示踪物的已知核酸片段（DNA 或RNA）
一、标记物的制备及类型
(一)制备方法 ➢ 20C，70Y 磷酸化法 切口平移法 广泛用于分子克隆过程； 缺点： ①只能在核酸的5’端引进一个放射性原子，会限制探针的比活度
2.单链DNA探针制备
单链DNA探针的优点
不存在互补双链，避免了DNA双链在重新复性时形成 无效杂交体的可能性
方法 ①合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的DNA片段， 并以其作为模板合成与其互补的探针（为DNA） ②将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于DNA的 RNA-pol识别的启动子）上的靶序列转录成RNA探针； 再在反转录酶的催化作用下制备cDNA探针 方法①需分离探针和未标记的核酸，而方法②只需 用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的 体外转录法是合成单链DNA探针的较好方法
此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDN探针
（三）两种新标记法
扫若仑标记和分子灯塔探针
1.扫若仑标记
扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有 胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、 PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可 达fg级别）
②探针含有模板DNA双链序列片段，在某些情况下，探针的互 补链会竞争靶DNA与探针的结合
➢ 20C，80Y中期
体外转录RNA探针法 此法合成效率高，不需分离模板DNA， 但 应避免RNase污染
(二)核酸标记类型
➢(同位素)核素标记 通常采用的同位素有32P、33P、35S，其 中32P活性强，信号比较好
但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以 在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）“预杂 交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如 P201“b”）
（3）5’端-寡核苷酸探针
在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷 酸盐法，使5’端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷 酸与DIG反应制成标记于5’端的寡核苷酸探针
放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂 交的探针，再通过X-射线衍射和放射自显影检测分析结果 （但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）
➢非同位素标记 以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示 踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相 仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）
（二）生物素
用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物 素能与链霉菌亲和素（或称链霉菌白蛋白）- 酶直接结合， 亲和素与生物素的结合力强（结合常数 Ka 1015 ）；这类 蛋白质有4个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的 生物素结合，又可以与探针中的生物素结合
1.切口平移法制备生物素酰化的探针
试剂及操作（课本）
②切口平移法
原理：当双链DNA分子的一条链有切口时，E.coli-DNApolⅠ可将核苷酸残基（如Dig-11-dUTP）加到切口处的 3’-OH端；又由于该酶具有5’→3’外切酶活性，所以它可从 切口的5’端除去核苷酸。5’端除去和3’端加入核苷酸同时进 行，导致切口沿着DNA模板链移动
4.寡核苷酸探针的制备
用DIG-11-ddUTP制备寡核苷酸探针，制备出来 的探针有3’端-、5’端-寡核苷酸标记和3’-端尾部寡 核苷酸标记之分
（1）3’端-寡核苷酸探针
（2）3’-端尾部寡核苷酸探针
在寡核苷酸3’-端加上10~100个碱基的尾巴。可提高 探针的灵敏度
在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡 核苷酸的3’-尾端
1.双链DNA探针标记 ①随机引物介导法 ➢随机引物：不均一的寡核苷酸混合物（6~12核苷酸单链DNA） ➢模板：单链DNA ➢酶：DNA-pol（klenow片段） ➢合成原料： dNTP混合物 ➢标记物：Dig-dUTP ➢其他试剂
随机引物介导法是将线性DNA模板上多处与随机引物 杂交，在DNA-pol的 催化作用下，新链中掺入DIG-dUTP, 从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）
3.PCR合成DNA探针
第一次循环之前于95℃变性7min，随后每次循环的条 件是： 95℃变性45s，60℃退火1min,72 ℃延伸2min（一 个循环）
用PCR法制备的DIG探针灵敏度高（即使含有很少量的 副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前， 要用凝胶电泳纯化探针） ，数量大
扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外 光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面 形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和 RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若 仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量 成正比关系
5.RNA探针的制备
采用体外转录法制备
①先克隆合适的模板DNA到相应的转录载体（如噬菌体）
②将得到的重组DNA线性化
③RNA-pol催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始转 录，并将修饰的核苷酸（如DIG-UTP）掺入到RNA链中，从 而获得具有一定长度和较高活性的RNA探针（每20~25个核 苷酸可结合一个DIG-11-UTP）
二、非核素标记
生物素、地高辛等非放射性示踪物都很容易掺入到 DNA或RNA中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或 用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检 测
此法标记量足（一次反应可标记数mg），稳定性 好（有效期可达2年）
（一）地高辛（DIG）