蛋白质酶抗体标记.ppt

（二）生物素
用生物素标记的探针与靶核酸杂交后，探针上的生物 素能与链霉菌亲和素（或称链霉菌白蛋白）- 酶直接结合， 亲和素与生物素的结合力强（结合常数 Ka 1015 ）；这类 蛋白质有4个结合生物素的位点，所以它既可与酶标记的 生物素结合，又可以与探针中的生物素结合
1.切口平移法制备生物素酰化的探针
1.双链DNA探针标记 ①随机引物介导法 ➢随机引物：不均一的寡核苷酸混合物（6~12核苷酸单链DNA） ➢模板：单链DNA ➢酶：DNA-pol（klenow片段） ➢合成原料： dNTP混合物 ➢标记物：Dig-dUTP ➢其他试剂
随机引物介导法是将线性DNA模板上多处与随机引物 杂交，在DNA-pol的 催化作用下，新链中掺入DIG-dUTP, 从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）
放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂 交的探针，再通过X-射线衍射和放射自显影检测分析结果 （但此法须在特殊实验室进行，防止同位素伤人）
➢非同位素标记 以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示 踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相 仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）
但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以 在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）“预杂 交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如 P201“b”）
（3）5’端-寡核苷酸探针
在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷 酸盐法，使5’端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷 酸与DIG反应制成标记于5’端的寡核苷酸探针
此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDNA可掺 入约50个生物素分子
2.随机引物介导法制备生物素酰化探针
（三）两种新标记法
扫若仑标记和分子灯塔探针
1.扫若仑标记
扫若仑（psoralen）是一种天然的三环化合物，其带有 胺活性基团衍生物可用来标记多种核酸（如DNA、RNA、 PCR产物和寡核苷酸等）。用其制成的探针灵敏度高（可 达fg级别）
扫若仑标记为非酶促反应，是用波长320~400nm的紫外 光照射，引起光循环反应，使带胺基的扫若仑以三环平面 形式插入核酸分子，并以共价键结合形成探针，DNA和 RNA时，共价键结合的位置分别在dT和U处；探针中扫若 仑衍生物的含量与核酸中胸苷（ dT ）或尿苷（U）的含量 成正比关系
第十一章 标 记
标记的概念
指以共价键的方式将放射性元素（如3H、 14C、32P、35S、125I）或非放射性物质（如地 高辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命 物质（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原 及某些小分子物质）上的过程
标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫 分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质 的定性、定量
2.单链DNA探针制备
单链DNA探针的优点
不存在互补双链，避免了DNA双链在重新复性时形成 无效杂交体的可能性
方法 ①合成可克隆于噬菌粒或M13噬菌体载体上的DNA片段， 并以其作为模板合成与其互补的探针（为DNA） ②将克隆于特定载体（带有可被噬菌体依赖于DNA的 RNA-pol识别的启动子）上的靶序列转录成RNA探针； 再在反转录酶的催化作用下制备cDNA探针 方法①需分离探针和未标记的核酸，而方法②只需 用不含RNase的DNase降解即可；故克隆DNA片段的 体外转录法是合成单链DNA探针的较好方法
5.RNA探针的制备
采用体外转录法制备
①先克隆合适的模板DNA到相应的转录载体（如噬菌体）
②将得到的重组DNA线性化
③RNA-pol催化核苷三磷酸在强启动子下游固定位点开始转 录，并将修饰的核苷酸（如DIG-UTP）掺入到RNA链中，从 而获得具有一定长度和较高活性的RNA探针（每20~25个核 苷酸可结合一个DIG-11-UTP）
由示踪物和被标记物构成的复合物称为探 针或某物的标记物
第一节 核 酸 标 记
核酸标记是指能与特定核酸序列（靶序列）发生特 异性互补（杂交），并含示踪物的已知核酸片段（DNA 或RNA）
一、标记物的制备及类型
(一)制备方法 ➢ 20C，70Y 磷酸化法 切口平移法 广泛用于分子克隆过程； 缺点： ①只能在核酸的5’端引进一个放射性原子，会限制探针的比活度
试剂及操作（课本）
②切口平移法
原理：当双链DNA分子的一条链有切口时，E.coli-DNApolⅠ可将核苷酸残基（如Dig-11-dUTP）加到切口处的 3’-OH端；又由于该酶具有5’→3’外切酶活性，所以它可从 切口的5’端除去核苷酸。5’端除去和3’端加入核苷酸同时进 行，导致切口沿着DNA模板链移动
3.PCR合成DNA探针
第一次循环之前于95℃变性7min，随后每次循环的条 件是： 95℃变性45s，60℃退火1miBiblioteka Baidu,72 ℃延伸2min（一 个循环）
用PCR法制备的DIG探针灵敏度高（即使含有很少量的 副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前， 要用凝胶电泳纯化探针） ，数量大
二、非核素标记
生物素、地高辛等非放射性示踪物都很容易掺入到 DNA或RNA中制成核酸探针。其信号可采用荧光染料、 碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶直接与生物素偶联，或 用荧光染料、碱性磷酸酶与抗地高辛抗体偶联进行检 测
此法标记量足（一次反应可标记数mg），稳定性 好（有效期可达2年）
（一）地高辛（DIG）
4.寡核苷酸探针的制备
用DIG-11-ddUTP制备寡核苷酸探针，制备出来 的探针有3’端-、5’端-寡核苷酸标记和3’-端尾部寡 核苷酸标记之分
（1）3’端-寡核苷酸探针
（2）3’-端尾部寡核苷酸探针
在寡核苷酸3’-端加上10~100个碱基的尾巴。可提高 探针的灵敏度
在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡 核苷酸的3’-尾端
②探针含有模板DNA双链序列片段，在某些情况下，探针的互 补链会竞争靶DNA与探针的结合
➢ 20C，80Y中期
体外转录RNA探针法 此法合成效率高，不需分离模板DNA， 但 应避免RNase污染
(二)核酸标记类型
➢(同位素)核素标记 通常采用的同位素有32P、33P、35S，其 中32P活性强，信号比较好