免疫细胞体外诱导及培养

过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点，但对MHCI类分子阴性的肿瘤细胞无效，而NK细胞(Natural killer cell, NK细胞)由于表达MHCI类分子的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killer inhibitory receptor, KIR)，可以杀灭MHCI类分子阴性的肿瘤，随着对NK细胞研究的深入，目前NK细胞用于肿瘤免疫治疗成为研究热点。19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者一个新的希望。自然杀伤(natural killer, NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。

自然杀伤细胞表面标志与分类

1．依据表面标志分为CD56bright和CD56dim两个亚群NK细胞表达众多表面分子，但只具有相对特异性。通常将CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴样细胞定为NK细胞，并以CD56的表达密度不同，将NK分为CD56bright和CD56dim两群。CD56bright NK细胞高表达CD56、CD94／NKG2A和L选择素(CD62L)；低表达CDl6和KIR；表达高亲和力的IL2受体(1L-2RapY)。而CD56dim NK细胞高表达CDl6、PEN5、KIR和LFA―1；低表达CD56，CD94／NKG2A；仅表达不带。链的中亲和力的IL-2受体(IL-2Rβγ)。

NK细胞亚群CD56bright和aD56dim的表型特点

2．依据细胞因子分泌格局分为NKl和NK2两个亚群NK细胞也存在着类似Thl和Th2样的亚群。分离外周CDl6+，或CD56+细胞，用ILl2和抗IL―4抗体可以诱导出分泌IFN―Y的Thl型NK亚群，用IL4和抗体诱导出分泌IL5、ILl3的Th2型NK细胞亚群，分别命名为NKl和NK2。也有人认为NK细胞发育经历K2一NK0一NKl的过程。在这一过程中IL4促进NK2增殖；ILl2促使NK2向NKl转变，并促进NKl的或熟。

3．依据黏附功能分为黏附NK和非黏附NK两个亚群根据NK细胞在IL2的诱导下表现出的黏附能力，分为黏附NK(A―NK)和非黏附NK(NA―NK)两个亚群。A―NK细胞的表型比较均一，主要为CD3―CD56dim CDl6十IL2R+，不含CD56bright细胞。NA―NK细胞是具有不同表型的异质性群体，各种表型如CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。

方法：1.采取10例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科10例AML患者外周血15ml,运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞，分别放于含有SCGM培养基

的培养孔中培养，前5d加入0.5ul CD3McAb，在培养的第5d，倒掉含有CD3McAb 的培养液，加入含有rhIL-2的SCGM培养基。隔日补充一次培养液，直至第25d 。

2. 运用细胞计数仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的细胞数量及细胞存活率。

3. 运用流式细胞仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d细胞中的NK细胞百分率和T细胞百分率。

4. 采用比色法检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d分选出的NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性。

健康志愿者即健康人群NK细胞的最佳培养时间间期是20d。

1．细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法

于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6/ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100ul二甲基亚砜（DMSO）轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度（OD值），取3孔均值，OD 值高则增殖快。

2. 细胞杀伤活性的测定采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定

靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔（E+T），效应细胞对照孔（E）和靶细胞对照孔（T），每组设3个复孔，操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下［2］:细胞杀伤活性（%）=［1+（OD E+T -OD E ）/OD T ］×100.

3. 细胞表型分析

细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK 细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞仪检测并分析CD11 c 的表达。

4. 透射电镜标本制备

在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心（4000rpm×5min），

用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常规处理电镜标本。

目的：通过改进培养基及细胞因子体系从而制订更优的NK细胞体外培养扩增方案，为临床NK免疫细胞治疗提供实验依据。

方法：4例血细胞分离机单采的新鲜白细胞及3例复苏的G-CSF动员后的外周血造血干细胞(PBSCs),通过破红、去血小板、弃贴壁细胞等处理,调节悬浮细胞浓度

至5×106/ml，添加细胞因子(包括1000U/ml rh IL2、10ng/ml rh IL12、10ng/ml rh IL15、10ng/ml rh IL21)后培养于37℃5%CO2孵箱中6天。根据不同培养基及是否添加rh IL-18将实验组分为AIM-V±rh-IL18组及SCGM±rh-IL18组,rh IL-18浓度为20ng/ml。每隔2~3天半量换液，调节细胞浓度至2×106/ml,并补充相应细胞因子。收集培养到第3天(D3)及第6天(D6)的细胞进行计数、NK纯度及功能表型检测。

结果：SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞扩增能力明显增强,培养到D6天NK细胞绝对值上调4~8倍,NK纯度提高10%~20%(P0.05)。培养到D6天时,SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞的穿孔素、颗粒酶的表达分别上调(19±4)%及(10±4)%(P0.05),迁移表型CD62L及成熟表型CD57的表达分别上调(12±4)%及(7±2)%(P0.05)。而且SCGM+rh IL18能使NK细胞分泌更高水平IFNγ(P0.05)。另外,NK细胞的功能表型及分泌IFNγ的能力随着培养时间的延长明显递增(D6D3D0)(P0.05)。

结论：本实验证明SCGM培养基联合IL-12/15/18是体外培养制备NK细胞的更好策略,能进一步提高NK细胞的纯度、绝对值、功能表型及分泌IFNγ的能力。本实验为临床上同种异体NK细胞治疗移植后复发AML提供了理论依据：有望进一步提高GVL效应并减少GVHD发生。

恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在男性中居第六位，女性中居第八位，儿童及35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解；移植和免疫治疗。CTL (Cytotoxic T cell, CTL)细胞目前在血液临床方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。根据移植物的来源不同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无G VHD，移植后生活质量较高，但因无GVLE (graft-versus gost effect,，GVLE)，易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞，复发问题可能会在一定程度上得以解决。或自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞，增加GVLE，在某种程度上可能会改变自体移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneic stern cell transplantion, Allo-S CT)，由于存在GVLE，使得一些患者能够得以长期生存，然而伴随而来的移植物抗宿主病(Graft versus host disease, GVHD)，严重感染，植入失败，造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVLE的效应细胞，也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴细胞输注(Donor lymphocyte transfusions, DLT)能诱导出GVLE消除白血病复发，CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症，如何得到最佳疗效，使DLI得到更好的应用，是现在临床面临的一大课题。