免疫细胞体外诱导及培养
过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点，但对MHCI类分子阴性的肿瘤细胞无效，而NK细胞(Natural killer cell,NK细胞)由于表达MHCI类分子的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killer inhibitory receptor,KIR)，可以杀灭MHCI类分子阴性的肿瘤，随着对NK细胞研究的深入，目前NK细胞用于肿瘤免疫治疗成为研究热点。19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者一个新的希望。自然杀伤(natural killer, NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。
自然杀伤细胞表面标志与分类
1．依据表面标志分为CD56bright和CD56dim两个亚群NK细胞表达众多表面分子，但只具有相对特异性。通常将CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴样细胞定为NK细胞，并以CD56的表达密度不同，将NK分为CD56bright和CD56dim 两群。CD56bright NK细胞高表达CD56、CD94／NKG2A和L选择素(CD62L)；低表达CDl6和KIR；表达高亲和力的IL2受体(1L-2RapY)。而CD56dim NK细胞高表达CDl6、PEN5、KIR和LFA―1；低表达CD56，CD94／NKG2A；仅表达不带。链的中亲和力的IL-2受体(IL-2Rβγ)。
NK细胞亚群CD56bright和aD56dim的表型特点
2．依据细胞因子分泌格局分为NKl和NK2两个亚群NK细胞也存在着类似Thl和Th2样的亚群。分离外周CDl6+，或CD56+细胞，用ILl2和抗IL―4抗体可以诱导出分泌IFN―Y的Thl型NK亚群，用IL4和抗体诱导出分泌IL5、ILl3的Th2型NK细胞亚群，分别命名为NKl和NK2。也有人认为NK细胞发育经历K2一NK0一NKl的过程。在这一过程中IL4促进NK2增殖；ILl2促使NK2向NKl转变，并促进NKl的或熟。
3．依据黏附功能分为黏附NK和非黏附NK两个亚群根据NK细胞在IL2的诱导下表现出的黏附能力，分为黏附NK(A―NK)和非黏附NK(NA―NK)两个亚群。A―NK细胞的表型比较均一，主要为CD3―CD56dim CDl6十IL2R+，不含CD56bright细胞。NA―NK细胞是具有不同表型的异质性群体，各种表型如CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。
方法：1.采取10例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科10例AML患者外周血15ml,运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞，分别放于含有SCGM培养基
的培养孔中培养，前5d加入0.5ulCD3McAb，在培养的第5d，倒掉含有CD3McAb 的培养液，加入含有rhIL-2的SCGM培养基。隔日补充一次培养液，直至第25d 。
2.运用细胞计数仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的细胞数量及细胞存活率。
3.运用流式细胞仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d细胞中的NK细胞百分率和T细胞百分率。
4.采用比色法检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d分选出的NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性。
健康志愿者即健康人群NK细胞的最佳培养时间间期是20d。
1．细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法
于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×10 6/ml浓度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100ul二甲基亚砜（DMSO）轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度（OD值），取3孔均值，OD 值高则增殖快。
2. 细胞杀伤活性的测定采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定
靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同孵育孔（E+T），效应细胞对照孔（E）和靶细胞对照孔（T），每组设3个复孔，操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下［2］:细胞杀伤活性（%）=［1+（OD E+T -OD E ）/OD T ］×100.
3. 细胞表型分析
细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK 细胞，按5×10 5 个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞仪检测并分析CD11 c 的表达。
4. 透射电镜标本制备
在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心（4000rpm×5min），
用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常规处理电镜标本。
目的：通过改进培养基及细胞因子体系从而制订更优的NK细胞体外培养扩增方案，为临床NK免疫细胞治疗提供实验依据。
方法：4例血细胞分离机单采的新鲜白细胞及3例复苏的G-CSF动员后的外周血造血干细胞(PBSCs),通过破红、去血小板、弃贴壁细胞等处理,调节悬浮细胞浓度
至5×106/ml，添加细胞因子(包括1000U/ml rh IL2、10ng/ml rh IL12、10ng/ml rh IL15、10ng/ml rh IL21)后培养于37℃5%CO2孵箱中6天。根据不同培养基及是否添加rh IL-18将实验组分为AIM-V±rh-IL18组及SCGM±rh-IL18组,rh IL-18浓度为20ng/ml。每隔2~3天半量换液，调节细胞浓度至2×106/ml,并补充相应细胞因子。收集培养到第3天(D3)及第6天(D6)的细胞进行计数、NK纯度及功能表型检测。
结果：SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞扩增能力明显增强,培养到D6天NK细胞绝对值上调4~8倍,NK纯度提高10%~20%(P0.05)。培养到D6天时,SCGM+rh IL18相比AIM-V组能使NK细胞的穿孔素、颗粒酶的表达分别上调(19±4)%及(10±4)%(P0.05),迁移表型CD62L及成熟表型CD57的表达分别上调(12±4)%及(7±2)%(P0.05)。而且SCGM+rh IL18能使NK细胞分泌更高水平IFNγ(P0.05)。另外,NK细胞的功能表型及分泌IFNγ的能力随着培养时间的延长明显递增(D6D3D0)(P0.05)。
结论：本实验证明SCGM培养基联合IL-12/15/18是体外培养制备NK细胞的更好策略,能进一步提高NK细胞的纯度、绝对值、功能表型及分泌IFNγ的能力。本实验为临床上同种异体NK细胞治疗移植后复发AML提供了理论依据：有望进一步提高GVL效应并减少GVHD发生。
恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在男性中居第六位，女性中居第八位，儿童及35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解；移植和免疫治疗。CTL (Cytotoxic T cell, CTL)细胞目前在血液临床方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。根据移植物的来源不同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无G VHD，移植后生活质量较高，但因无GVLE (graft-versus gost effect,，GVLE)，易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞，复发问题可能会在一定程度上得以解决。或自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞，增加GVLE，在某种程度上可能会改变自体移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneic stern cell transplantion, Allo-S CT)，由于存在GVLE，使得一些患者能够得以长期生存，然而伴随而来的移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)，严重感染，植入失败，造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVLE的效应细胞，也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴细胞输注(Donor lymphocyte transfusions, DLT)能诱导出GVLE消除白血病复发，CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症，如何得到最佳疗效，使DLI得到更好的应用，是现在临床面临的一大课题。
ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1)，ALL对NK的治疗效果差，C TL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。CTL细胞在免疫治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。临床上发现，植入是否成功以及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显著相关。异基因干细胞移植即便是完全供者型，也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞，找出针对自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆，发挥RVLE (Recepient-versus leukemi effect, RVTE)，在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点，不仅能发挥自身识别肿瘤的免疫清除功能，而且协同供者成分发挥杀瘤效应，同时有助于了解代替免疫与过继免疫的理念，分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生存，而一些患者在完全供者嵌合(FDC)状态下出现原疾病复发的原因。Wilms tu mor antigen-1(WT1)过度表达在70%-90%的ALL病人中，而这样的病人有着高的复发率。体外及小鼠研究中的证实，WT1是一个有意义且广泛表达的白血病抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有WTl特异性的T细胞，说明WTl的表达很容易诱导出T细胞反应。WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减轻密切相关。高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死性GVHD已得到证实。如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的CTL克隆，对正常细胞无明显作用，无GVHD，无排斥，宿主完全耐受，扩增率高并能在体内增殖，具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力，那么分离G VHD与GVL即将成为可能，改善自体移植效果成为可能，增进过继免疫治疗成为可能。那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞？这就是本实验的主要研究目标：拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆，并从多方位鉴定其功能特性及其来源，为进一步的研究及应用打下坚实的基础。
方法：1.体外DC培养树突状细胞(dendritic cell, DC)主要的功能就是特异性抗原提呈。成熟DC加工处理抗原肽-MHC-1复合物，并提呈给T细胞。DC传统培养方法大致需要4-10天，前几天为诱导分化期，最后一天为诱导成熟期。DC成熟所需时间太长，与体外CTL培养不能同步。我们改进了DC培养为2天诱导成熟法。与传统培养法及7天培养法方法比较：(1)利用四色流式细胞技术进行表型分析。(2)利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。(3)通过HLA-A*0201同型的Tc细胞对WT1/HLA-A*0201阳性肿瘤细胞NB4的杀伤率来评价DC的提呈功能。2.健康供者CTL细胞单个克隆培养(1)免疫磁珠分选CD56-CD8+细胞：HLA-A*0201健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)行免疫磁珠去CD56+的细胞(NK)细胞，再行CD8阳选，PHA/WTI肽间段性刺激下行体外扩增。(2)流式细胞分选：以CD19-细胞群中设门，WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞为目的CTL细胞，收集。(3)饲养细胞的制备：三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者PBMNC进行γ-射线50Gy照射，制备成饲养细胞。(4)CTL细胞克隆制备：所分选的目的细胞行有限稀释法制备单个克隆，按比例与抗原负载的DC及饲养细胞混合后体外扩增培养。(5)CTL克隆细胞表型鉴定：流式检测CD45RA/ CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a分子的表达率。(6)CTL
克隆胞内分子检测：流式检测胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率。(7)分泌功能检测：CBA法检测IL-2、IL-4、1L-6、IL-10、TNF-α、IFN-y、IL-17在CTL细胞培养上清的浓度。(8)细胞毒性的检测：克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。3. 白血病NASCT患者外周血来源的C TL单个克隆培养(1)体外刺激扩增：加用刺激因子与WT1肽进行体外特异性T c细胞诱导扩增。(2)扩增后的Tc细胞流式分选：CD3+CD19-细胞群设门，WT1 /HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞分选后收集(CTL细胞)。(3)三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行Y-射线50Gy照射，制备成饲养细胞。(4)有限稀释法制备克隆细胞，按比例混合抗原负载的DC及饲养细胞体外扩增培养。(5)流式检测克隆表型分子CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a的表达率。(6)CTL克隆细胞胞浆毒性颗粒Granzy meB、Perforin的阳性率检测。(7)CBA法检测克隆细胞分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17的浓度。(8)克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率的检测来鉴定其功能(CFSE/PI双标法)。四、白血病NASCT患者与健康供者体外培养CTL克隆的比较研究利用上述方法体外平行培养两类不同来源的CTL克隆，进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。五、CTL克隆细胞来源与功能的镜下研究(一)性别染色体荧光原位杂交(FISH)区别CTL克隆的来源选用5例供受者性别差异的白血病移植后患者体外CTL克隆细胞进行性别探针杂交，荧光显微镜下观察杂交信号，根据x,Y染色体的不同信号来鉴定克隆来源。
(二)激光共聚焦扫描镜下观察CTL克隆的形态与功能选取受者为HLA-A*0201阳性、供者非HLA-A*0201阳性的白血病HLA半相合NASCT后患者体外培养WTl特异性CTL克隆细胞，WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE标记CTL细胞，PK H26标记DC，CFSE标记靶细胞NB4(WT1及HLA-A*0201双阳性的人急性早幼粒细胞白血病瘤株)，共同孵育2h，镜下观察形态与功能。(三)扫描电镜观察克隆细胞细微结构与功能白血病移植后患者WT1阳性的CTL克隆细胞体外培养4-6周后，收集细胞并依次与DC及NB4细胞以一定比例混合培养2h后，收集处理细胞，镜下观察克隆细胞的功能。六、白血病NASCT患者与健康供者CT L克隆蛋白表达差异分别选取三份健康人及白血病患者移植后体外扩增培养6周后的CTL克隆细胞，收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双项电泳、染色、扫锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白，酶切，质谱分析。健康人外周淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋白差异谱对照，生物信息检索分析找出反应蛋白。结果一、体外树突状细胞培养1、3种方法培养的未成熟及成熟DC在形态上无差别；2、3种培养法未成熟DC表型存生明显差异：传统培养法CD1a,CD86(P0.01),CD83,HLA-DR(P0.05)的表达均明显高于2天法；传统培养法CD1a(P0.01)的阳性表达率明显高于7天法；7天培养法CD83, HLA-DR(P0.05)的表达明显高于2天法；7d法的CD83(P0.05)明显高于传统法；成熟DC表型差异：2天培养法与7天培养法无差异；2天培养法CDla,CDllc,C D80,HLA-DR的表达明显高于传统培养法(P0.05)；7天培养法CD80,CD83的表
达明显高于传统培养法(P0.05)；3、3种培养法成熟DC的抗原活性：2天及7天培养法DC辅助Tc对靶细胞的杀伤率(75.8±7.1)%,(74.6±3.2)%明显高于传统法(6 5.2±1.3)%(P0.01)。二、健康供者CTL克隆细胞培养与鉴定1、表型：CD3+CD8 +的细胞占(98.7±0.2)%,CD27占(62.3±10.0)%,CD28占(71.9±7.9)%；CD107a占(4 9.0±11.0)%,CD45RA占(65.1±8.4)%,CD45RO占(34.3±±4.2)%,CCR7占(18.1±5.2)%。
2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(43.9±7.4)%,穿孔素：(32.7±6.8)%。
3、CT L克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+细胞群占(9.0±2.0)%；CD45RA-CD45 RO+CD27+CCR7+的细胞群占(13.0±2.4)%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-细胞群占(26.1±±5.9)%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(61.3±7.9)%。
4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(76±3.9)%。
5、分泌功能(pg/ ml)：IL-2浓度为(2129.5±±414.7)、IL-4(17.5±9.1)、IL-6(21.6±9.7)、IL-10(24.8±8.
6)、TNF-α(40.8±21.5)、IFN-γ(102.3±61.0)、IL-17(18.5±8.6)。6、对NB4的杀伤率(89.7±7.6)%明显高于对U937和K562杀伤率(19.0±4.3)%,(19.7±5.2)%,P0.05。对白血病原始瘤苗AML和ALL的杀伤率(54.0±16.6)%,(56.5±12.4)%,无差别P0. 05。三、白血病NASCT患者CTL克隆细胞的培养与鉴定1、表型：CD3+CD8 +的细胞占(98.6±0.5)%,CD27占(66.3±8.1)%,CD28占(70.1±7.8)%；CD107a占(51. 4±7.7)%,CD45RA占(65.7±6.3)%,CD45RO占(33.9.1±4.5)%,CCR7(17.1±2.7)%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(40.6±9)%,穿孔素(30.9±6.2)%。3、克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+占(12.6±3.2)%CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占(1 7±4.6)%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(19.5±3.6)%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(62.1±7.4)%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(70.2±8.5)%。5、分泌功能：IL-2(2365.0±246.1)%、IL-4(40.5±8.3)%、IL-
6(1705.3.6±416.2)%、IL-10(63.2±22.2)、TNF-α(121.3±35.3)%、IFN-γ(219.5.3±65.
1)%、IL-17(14.5±5.0)%。6、对NB4的杀伤率(84.5±5.1)%明显高于对U937和K 562杀伤率(21.5±5.5)%,(22.3±6.5)%,P0.05。对白血病原始瘤苗AML和的杀伤率(6 6.4±7.6)%明显高于对ALL的杀伤率(58.6±5.6)%,P0.05。四、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆比较两者表型无差异：毒性颗粒表达率无差异；患者分泌的细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ明显高于健康供者(P0.01),IL-17无差别(P0.05)；细胞毒功能未发现明显差别。五、白血病NASCT患者CTL克隆来源与功能研究1、FISH发现了白血病NASCT患者体外培养CTL克隆中有受体的CTL细胞；2、LMST发现白血病NASCT后受者的CTL细胞并直接观察到其细胞毒性。2、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的CTL克隆细胞呈典型T 细胞形态,与DC细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功能。六、两类单克隆CTL细胞蛋白表达差异1、NASCT患者与健康供者外周血未培养的淋巴细胞蛋白差异点有30个,鉴定出13个功能明确的蛋白。2、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆细胞差异蛋白点44个,鉴定出25个功能蛋白,明显上调的1 8个,下调的12个,4个为未命名蛋白。3、白血病及移植相关的共同反应蛋白有4个,分别为Coactosin-like protein、Septin-1]、Purine nucleoside phosphorylase,
GATA3。结论(1)2天诱导成熟的DC形态功能都达到功能DC的标准，这种培养方法是成功的。(2)健康人与白血病患者体外CTL单个克隆培养方法是成功的、在体外能有效扩增(单个细胞扩增到1-5×107个细胞)，扩增成功率为78%。经一系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性CTL细胞。(3)培养的CTL克隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型，说明克隆细胞是由一个细胞分化增殖形成不同阶段的细胞亚群组成。(4)白血病NASCT患者来源的CTL克隆分泌功能明显比健康供者的CTL克隆旺盛。(5)免疫磁珠分选结合五聚体流式分选可以得到高纯度的CD8+的CTL细胞，可以做为单个克隆培养的备用细胞。(6)HLA 限制性肽特异性的五聚体与FISH相互补充，可以鉴定一部分NASCT患者CTL 克隆的来源。(7)健康供者与白血病NASCT患者之间的PBMNC及CTL克隆在蛋白表达上存生着明显差异。
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ、IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞、B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
1．DC培养用细胞因子：
GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：
GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的?功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。
GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
IL-4(白细胞介素-4)
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不?表达CD14。
TNF-α(肿瘤坏死因子-α)
TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II
类分子区室(class IIcompartment)消失，但能够上调细胞表面?MHCI类、II类分子和B7家族分子(CD80、CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(matureDC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
2．CIK培养用细胞因子和抗体：
CD3激发型单抗：)
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识
别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T 细胞表面的?辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck、Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂肌醇途径MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(?如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
IL-2(白细胞介素-2)
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
IFN-γ(干扰素-γ)
IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-γ，
培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
IL-1a(白细胞介素-1a)
IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-γ和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
1.外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。
2．(可选步骤)肿瘤抗原的制备]
用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；2.2 无菌生理盐水洗3次；
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5 用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37℃水浴中解冻10 min。反复3-5次；
注：也可以-80℃/37℃反复冻融3-5次。
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
2.8 收取上清，0.22μm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
2.9 -80℃保存备用。
3.0 CIK细胞的培养及鉴定
3.1 步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
3.2 37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
3.3 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100U/ml的重组人IL-1a。
3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2300 U/ml；
3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞,此时数量应达到1x109个以上；
3.8 CIK细胞质控：
3.8 .1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
培养细胞活力的检测台盼蓝排斥实验
1.制备单个细胞悬液，适当稀释；
2.向细胞悬液中加入0.4% 台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为0.04% ；
3.在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成淡蓝色。
注意事项：在三分钟内完成死细胞计数，否则部分活细胞也会被染色，影响实验的准确性。
3.8 .2用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察
CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。
4.DC细胞的培养及鉴定
4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
4.2 每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
4.3 (可选步骤)?在培养的第5d, 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
4.4 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
4.5 在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
4.6 DC的质检：
4.6 .1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
4.6 .2流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达以确定DC是否成熟。
5.0 DC-CIK细胞的制备和质检
5.1 收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1:10(数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
5.3 在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
5.4 DC-CIK细胞的质检：
5.4 .1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
5.4 .2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细
胞的比例应在20%以上。
5.4 .3细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞
或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96 孔U
型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后
取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
5.4 .4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，
及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
注：AF即Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞中最好使用无动物成分的重组细胞因子。
诱导分化成熟脂肪细胞方案
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
细胞培养基本方法.docx
1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?
(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式
体外细胞培养
第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等
脂肪细胞的基础知识
脂肪细胞的基础知识 脂肪细胞的生长全过程及其形态变化脂肪母细胞，是指能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化成为单能干细胞。它可保持着干细胞增殖活跃的特性，脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，即通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合、接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为：多能干细胞——脂肪母细胞——前脂肪细胞——不成熟脂肪细胞——成熟脂肪细胞。生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积，以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“O”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无分裂增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。 张高娜,梁正翠.动物脂肪细胞的研究进展[J].饲料工业,2009,30(2):42-44. 脂肪细胞由起源于中胚层的间充质干细胞逐步分化形成,按间充质干细胞→脂肪母细胞→前脂肪细胞→不成熟脂肪细胞→成熟脂肪细胞的过程发展。前脂肪细胞在多种转录因子调控下,激活脂肪组织相关基因,并在这些基因的顺序性调控下,经一系列复杂的步骤分化为成熟脂肪细胞。 张艳.脂肪细胞分化过程中的分子事件[J].儿科药学杂志,2008,14(1):56-57.
间充质干细胞 概念： 不同文献中，分别命名为抽脂处理细胞（processed lipoaspirate cells, PLA），脂肪基质微管碎片细胞（stromal vascularfraction cells, SVF），脂肪组织源基质细胞（adipose-tissue derived stromal cells, ATSCs），脂肪源中胚层干细胞（adipose-derived mesodermal stem cells, ADMSCs）等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。 李惠侠,屈长青. 脂肪组织源性干细胞研究进展[J]. 生理科学进展,2007,38(2) 脂肪细胞是由起源于中胚层的间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)逐步分化、发育而来，MSC主要分布于脂肪组织和骨髓中。脂肪细胞不同发育阶段的两类细胞系为多能干细胞系和前体脂肪细胞系，前者为不定向的细胞系，能转变为稳定的脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞，后者为定向的细胞系，是目前体外研究脂肪细胞分化应用最为广泛的细胞系。 庞卫军,李影. 脂肪细胞分化过程中的分子事件[J]. 细胞生物学杂志,2005,27: 497-500. 脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, ADMSCs) 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新及多向分化潜能,是一种 具有潜力的组织工程种子细胞。目前研究得比较多的是骨髓来源的MSCs,但骨髓中的间 充质干细胞数量很少(约占细胞总数的1/105),且存在取材困难等问题。MSCs广泛分布于 其他组织中,包括肌肉、血管、肝脏、胰腺和脂肪等。 ADMSCs表面有CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH-2、SH-3、STRO-1等多 种抗原标志。 李冬艳,宇丽. 脂肪来源的间充质干细胞分离方法的改进[J]. 暨南大学学报(医学版),2007,28(6). 脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs） Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞(MSCs)形态相似，称之为脂肪干细胞（ADSCs)，平均每300 ml脂肪组织可获得2×108～ 6×108个这样的细胞。ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、 CD70、CD105/SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45为阴性反应。此外， 它们还具有各自特征性的表达分化抗原：ADSCs具有特征性表达分化抗原CD49d，而MSCs具有特征性表达分化抗原CD106。 张高娜, 梁正翠. 动物脂肪细胞的研究进展[J]. 饲料工业,2009,30(2) 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具备干细胞特点的细胞系，具有自我更新能力、长期的活性和多系分化潜能。 脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs），以其取材方便、来源丰富等多种优势逐渐取代骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）。 免疫表型：研究发现ADSCs主要表达CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、CD29、CD49e和HLA-ABC，而不表达CD34、CD3、CD19、CD45、CD14、CD117、CD31、CD62L、CD95L和HLA-DR。这个结果和其他的MSCs几乎一致。但ADSCs与BMSCs也有差别：大部分BMSCs表达CD10，而表达CD10的ADSCs仅占5%～20%；几乎所有的ADSCs表达CD49f和CD54，而BMSCs极少表达。 周苏娜,张明鑫. 脂肪来源的间充质干细胞的生物学特征及临床应用[J]. 中国现代普通外科进展,2009,12(1). 不同细胞的表面标志是不同的，脂肪干细胞的表面标记为：CD9、CD10、CD13、CD29、CD10、CD44、CD49e、CD49d、CD54、CD55、CD59、CD90、CD105、CD107、CD146、
诱导分化成熟脂肪细胞方案
诱导分化成熟脂肪细胞 方案 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.
最新 人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法-精品
人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法 间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，下面是小编搜集整理的一篇探究干细胞体外分离培养方法的，供大家阅读查看。 大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1-2].人脂肪间充质干细胞(humanadipose-derivedmesenchymalstemcells,hAD-SCs)是由Zuk等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的hADSCs体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。 1材料与方法 1.1材料成人腹部大网膜脂肪组织7例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄17~33岁，平均为26岁，健康状况良好，无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶(Gibco公司),胎牛血清(Hyclone公司),鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE及其相应同型对照(eBio-sciences公司),地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸钠、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素(Sigma公司). 1.2方法 1.2.1hADSCs细胞分离培养产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约 10ml,PBS清洗，剪碎，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化45min,10%胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200目细胞筛过滤，再离心。加入完全培养液(含10%胎牛血清、1×双抗的低糖DMEM)重悬，以5×104/ml接种于6孔板，置于37℃,5%CO2培养箱中培养，48h后首次换液，之后每周换液2次，待细胞生长至80%融合时，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化传代。实验时用第3~9代细胞。 1.2.2细胞免疫表型检测取消化消化贴壁的第3代hADSCs,1000r/min离心5min,用PBS重悬分装于1.5ml的EP管中，每管100μl,细胞密度为105/ml,加入鼠抗人CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA-DR等单克隆抗体及其同型对照。4℃避光孵育30min,PBS洗2次，加PBS300μl重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。 1.2.3细胞生长曲线和倍增时间取处于对数生长期的第3、6和9代细胞，消化贴壁细胞，将细胞按5×103/孔接种于24孔板，分7组，每组3孔，置培养箱培养。每24h用台盼蓝计数一次，每次计3孔，取其平均数;连续计数7d,
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
人脂肪干细胞(ADSCs)体外培养的研究及应用进展
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/648565548.html, 人脂肪干细胞（ADSCs）体外培养的研究及应用进展 作者：徐巧瑜等 来源：《中国美容医学》2012年第13期 干细胞是一类具有自我更新与增殖能力的细胞，按其分化阶段不同分为胚胎干细胞与成体干细胞，目前对成体干细胞的研究较为广泛。人的脂肪干细胞（adipase derived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的干细胞，具有自我更新及多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。自从2001年ZUK[1]首次通过吸脂术抽取脂肪组织悬液培养出多能干细胞，ADSCs因其取材方便，一次取材获取的细胞数量大，对供体创伤 小等优点已成为近年来种子细胞的研究热点。 1 ADSCs的获取 脂肪组织是人体中含量最丰富的组织，占正常体重的10%～29%[2]。它的存在主要有两种形式：棕色脂肪组织及白色脂肪组织。其中棕色脂肪组织仅在婴儿期发挥作用，而白色脂肪组织在人体起到储存及释放能量的调节器作用，主要分布在腹腔内的网膜、肠、肾周及臀部、大腿、腹部的皮下区域[3]。因此研究重点集中在白色脂肪组织。目前，ADSCs主要通过局部脂肪切除术及抽脂术后的脂肪组织中获取，但Vallee等[4]发现由抽脂术获得的脂肪有更好的成 脂潜力、重建三维脂肪替代物能力。供者的年龄也是影响ADSCs的因素。一般来说供者的年龄越小，细胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]却认为ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，ADSCs数量凋亡倾向也不同。Schipper等[6]发现人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于获取ADSCs[7]。 2 ADSCs分离培养 2.1分离：目前常用的是酶消化法，将脂肪组织剪碎后采用胶原酶或胰酶消化、过滤离心后，使用含血清的培养基将沉淀重悬后接种于培养瓶中。沉淀物是多种细胞的混合物，又称为血管基质成分（Stromal vascular fraction，SVF），其中含有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞及血液来源的细胞，常需传代来纯化。 2.2 培养：体外培养需要合适的生长条件，培养基的选择很重要。常用的培养基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]报道L-DMEM比a-MEM更适合培养ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于维持ADSC的多分化潜能，而培养液中的抗生素对ADSC 的细胞表型和分化能力无影响。Bunnell等[10]认为25%血清浓度可能使ADSC向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。对于最优的糖浓度及血清浓度尚不明确。为了消除动物血清的使用带来的不良影响，部分文献开始介绍低人血清培养基或无血清培养基的使用。
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上
生物学通报２００７年第４２卷第９期细胞体外培养时为什么会贴到培养皿壁上 刘梅芳徐国恒‘（北京大学医学都生理系北京１０００８３） 北京市第２２中学的生物学教师陈珊问：动物细胞培养时为什么会出现贴壁现象？ 答：第１。绝大部分细胞在机体内的环境下是与其他细胞或者细胞外基质结合的，不是孤立存在的。第２，细胞与细胞或者细胞外基质结合的物质基础以及在体外培养中贴壁的物质基础是什么。 在体内，大部分细胞不是孤立存在的（血液中的细胞除外）。一般一种细胞具有一种特定的功能．不同种细胞有机组合在一起就构成能够完成较为完整的一项功能的器官。细胞之问，细胞与细胞外基质之间结合在一起，这使得每一部分组织或者器官具有一定的外形及特定的功能。血液在体内是起运输作用的，不停地流动，要通过只有几个“ｍ的毛细血管，所以血液中的细胞是单个存在的。否则就会发生血管阻塞。但是它们受到刺激．其表面与黏附有关的蛋白会被激活然后与其他细胞或细胞外基质结合．如血小板接触到破损内皮下的胶原被激活而黏附在局部，从而发挥止血的功能；如巨噬细胞可以将衰老的红细胞、血液中凋亡的中性粒细胞结合并将其吞噬，这些都应该是属于细胞之间的结合。另外有些研究表明细胞必须与其他的细胞发生联系才能够生存．如果没有其他细胞或者细胞外基质与之结合．此细胞就会发生凋亡，称为失巢凋亡。 细胞在体外培养的条件下的贴壁，首先并不是所有的细胞在体外培养的情况下都会贴壁，但大部分来自实体组织器官的细胞都会贴壁。贴壁的过程可能是这样的。细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（培养瓶，培养皿的底面），然后细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关。 细胞贴壁的过程使形态发生很大变化．细胞变形运动是细胞内骨架本身和细胞外基质共同作用的结果。细胞为什么要贴壁，可以想象一下．密度大于培养基的细胞（绝大部分细胞）会沉在底面上，那么细胞要生存必定改善这个环境。分泌细胞外基质，然后很自然就贴附在底面上了，而悬浮细胞．如淋巴细胞由于重力原因沉在培养瓶的底面，但是并不贴附，这可能与细胞表面的黏附分子少，以及分泌的细胞外基质过少有关．有人研究用细胞外基质处理培养器皿的底面．即增加细胞外基质，可以使悬浮的淋巴细胞贴壁。另外悬浮生长的细胞系ＴＨＰ一１受到某些药物刺激之后也可以贴壁．这可能与细胞本身分泌的细胞外基质以及细胞表面的黏附分子表达增多有关。密度小于水的细胞，如脂肪细胞，漂浮在液面上。所以不可能贴在底面上．但是如果将培养液加满，那么细胞能够与培养瓶上面的壁接触同样可以贴壁。因此可以说，细胞贴壁是适应环境的一种反应。 （Ｅ—ＩＩｌａｉｌ：ｘｕｇ＠ｂｊｗＬＩ．ｅｄｕ．ｃｎ） （ＢＨ） 欢迎订阅２００８年《生物学教学》杂志 《生物学教学）杂志是由华东师范大学主办，向国内外正式发行的全国教育类核心期刊。国内统一刊号：ｃＮ３１一Ｉ００９，ｃ４．国际标准刊号：１００４—７５４９。读者对象以中学生物学教师为主，兼顾高校和其他生物学工作者。主要栏目有：生物科学综述、国家课程标准与实验教材、现代教育论坛、教育教学研究、课堂教学设计与实践、信息技术、国外教育动态、考试与命题、实验教学、科技活动、教学参考、生物学科技信息、科学技术与社会、读者之窗等。另外，封面、封底刊登生物照片。 《生物学教学》杂志为８０页，月刊，国际标准１６Ｋ，２００８年定价：７．００元，全年８４元。国内订购：全国各地邮局，代号４—４５０。国外订购：中国国际图书贸易公司（北京３９９信箱，邮编：１０００４４），代号：Ｍ５１０５。如果错过了邮局订购时间，可以与杂志社联系邮购。杂志社地址：华东师范大学《生物学教学》杂志社，邮编：２０００６２．电话０２ｌ一６２２３２２２５。电子信箱：ｓｗｘｉｗ＠ｂｉｏ．ｅｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体
MDCK细胞培养基本技术方法 -2011本
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
T细胞体外培养
目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种： 1、CD3AK细胞 CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。 具体培养方法: 1、培养前1天以含CD3Ab 5 mg／L的磷酸盐缓冲液 (PBS)20 ml平铺培养瓶，4℃过夜包被； 2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2 次及1640培养液 冲洗1次，加入1 000 U／ml的 IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中； 3、24小时后加入1 000 U／ml的lL-2。 4、继续培养 2、CIK细胞 CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。
具体培养方法： 3、LAK细胞 LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。 4、TIL细胞 TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。 外周血单核细胞（PBMC）分离实验 血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。10ml抗凝血分2份（分离淋巴细胞可稍多）。 外周血单核细胞（PBMC）分离步骤： 1.吸出10ml新鲜抗凝血（含2%EDTA）至50ml离心管中，加入 10mlPBS混匀，此时共20ml； 2.2个50ml离心管内分别加入10ml外周血单核细胞（PBMC）分离 分层液； 3.向装有分层液的50ml的离心管分别加入10ml稀释样品，注意缓 慢加入，不要冲破液面，2000r/min离心20分钟； 4.巴氏管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一个离心管 中，避免吸入分层液和血浆（2管混入一个离心管）； 5.加入5ml PBS，1800r/min离心5分钟； 6.弃上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混匀成细胞悬液，
成年小鼠心脏脂肪细胞分离培养的protocol
PROTOCOL 1.Anesthetize mouse with 150uL heparin (100U/ml) + 0.5mL ketamine/xylazine stock 2.Sacrifice by opening thorax after toe pinch test. 3.Remove and cannulate heart, secure with vascular clip then 6-0 silk. Check cannulation by inflation. Heart should swell. 4.Perfuse heart with 1xPB for 4 min at 4ml/min (16mL) 5.Switch to DB for 3 min at 4ml/min (12mL) 6.Perfuse with DB+CaCl2 for 8 min at 4ml/min (32mL) 7.Heart will be mushy when fully digested and dripping ~16 drops/min 8.Remove from cannula, remove atria and great vessels 9.Place ventricles in sterile 60mm dish with 2.5ml DB 10.Tease ventricles into several pieces. Add 5mL Stopping Buffer (37°C) and pipette several times to release cardiomyocytes from tissue. Solution should turn cloudy. 11.Transfer cell solution to conical tube with 100μm mesh to filter cells from tissue. 12.Rinse dish with 2.5mL Stopping Buffer and add to tube through mesh. Final volume is 10mL. 13.Let CMs settle 10-20 min at 37°C and plate supernatant in 60mm dish. Let cells settle 2-3 hours in TC incubator. Wash and harvest CFs (plated cells) or change media and passage. 14.Harvesting CFs: a.Wash 2x5ml 1xPBS, add 1ml of 1xPBS. b.Scrape cells into Eppie, cfg twice 3min at 5000rpm at 4°C. c.Lyse in 350ul RLT+. SOLUTIONS FOR LANGENDORFF 10x perfusion buffer (stored at 4°C up to 1 month) 1L 500mL NaCl 70.3g 35.15g KCl 11g 5.5g KH2PO4.82g .41g Na2HPO4.85g .425g MgSO4●7H2O 3g 1.5g HEPES**(1M) 100mL 50mL pH to 7.4 with 1N NaOH ~3mL mQ H2O to 1L to 500mL **if HEPES is in powder form, add 13.01mg HEPES to 50mL mQ H2O. 1x perfusion buffer (PB) (make fresh) 250mL 500mL 10x perfusion buffer 25mL 50mL NaHCO3.0975g .195g Taurine .9375g 1.875g BDM (butadionemonoxime) .25g .5g Glucose .25g .5g pH to 7.4 with NaOH mQ H2O to 250mL to 500mL Filter through 0.2μm Stopping buffer (7.5mL/heart, make fresh, heat to 37°C before use) 1xPB 9mL FBS 1mL 100mM CaCl2 1.25μL Digestion buffer (DB) 1xPB 50mL 320U/mg collagenase II*50mg 100mM CaCl2**15μL *add immediately before use **BEFORE adding, remove 12.5mL to fresh tube (for Step 5), THEN add 15μL CaCl2 to remaining DB. Mix, then put 2.5mL on 60mm plate (for Step 8). Culture (Fibroblast) medium MEM 48.5mL Pen/Strep 0.5mL (1% final) L-glutamine 0.5mL (1% final) FBS 50mL (10% final)