绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养

绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养
罗 燕 ，赵 宗 胜 ，谷 新 利 ，邵 永 斌 ，时 敏
（石河子大学动物科技学院，石河子 ８３２００３）
摘要：为建立绵羊肌内前体脂肪细胞的体外培养模式，以便深入研究绵羊肌内脂 肪 组 织 的 发 育 和 沉 积 机 制 ，本 实 验 采用组织块法和单层细胞培养法对绵羊肌内前体脂 肪 细 胞 进 行 了 原 代 和 传 代 培 养 ，并 对 其 进 行 形 态 学 观 察、生 长 曲线测定、油红 Ｏ 染色鉴定及脂肪 含 量 测 定。 结 果 表 明：２ 种 方 法 均 能 培 养 出 成 分 均 一、增 殖 旺 盛 的 前 体 脂 肪 细 胞，且单层细胞培养法较组织块法能在短期内更快获得大量细胞。试验结果证实 成 年 绵 羊 的 肌 内 脂 肪 组 织 中 存 在 着 功 能 活 跃 的 可 调 控 的 前 体 脂 肪 细 胞 ，这 可 为 进 一 步 研 究 脂 肪 沉 积 机 制 及 优 化 绵 羊 肉 品 品 质 奠 定 基 础 。 关 键 词 ：绵 羊 ；肌 内 前 体 脂 肪 细 胞 ；细 胞 培 养 ；脂 肪 组 织 中 图 分 类 号 ：Ｓ８２６ 文 献 标 识 码 ：Ａ
肌 内 脂 肪 （Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｆａｔ，ＩＭＦ）是 存 在 于 肌 外膜、肌束 膜 或 肌 内 膜 上 的 脂 肪，营 养 状 况 好 的 家 畜，其肌纤维膜 的 毛 细 血 管 上 也 有 脂 肪 沉 积。 研 究 发现，畜禽ＩＭＦ 含量、比例和分布状况，与肌肉的多 汁性、嫩度、肉色、大 理 石 纹 以 及 肌 肉 ｐＨ 值 等 肉 品 评 价 指 标 都 有 很 强 的 相 关 性［１］，是 影 响 动 物 肉 品 质 和风味的决定因 素 之 一。 近 年 来，如 何 在 不 影 响 动 物 生 长 、并 保 持 整 体 脂 肪 率 较 低 的 情 况 下 ，适 当 提 高 肌内脂肪含量以提 高 肉 品 质，已 经 成 为 当 前 相 关 畜 牧生产面临的一个 重 要 课 题，而 对 于 作 为 肌 内 脂 肪 组 织 的 基 本 单 元 ——— 前 体 脂 肪 细 胞 的 增 值 分 化 能 力
本实验旨在摸索建立绵羊肌内前体脂肪细胞的 体 外 培 养 模 式 ，为 后 续 通 过 反 刍 动 物 营 养 调 控 （如 营 养 素 等 ）手 段 调 控 肌 内 脂 肪 的 发 育 、肌 内 脂 肪 沉 积 机 制的研究提供一种 简 便 有 效 的 细 胞 模 型，旨 在 为 今
收 稿 日 期 ：２０１１－０３－２３
速无菌分离肌内脂 肪 组 织，放 入 预 先 备 好 的 含 双 抗
（青、链霉 素 各 ４００ Ｕ／ｍＬ）的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ＰＢＳ） 中 ，带 回 实 验 室 。
１．１．２ 主 要 试 剂 配 置 和 仪 器 基 础 培 养 基：ＤＭＥＭ／Ｆ１２ 培 养 粉 １ 袋 （ＧＩＢ－
ＣＯ，１２５００－０６２），２．４３８ｇ ＮａＨＣＯ３，灭 菌 超 纯 水 定 容至１０００ｍＬ。完全培养基：９０ｍＬ 基础培养基，１０ ｍＬ 胎 牛 血 清 （ＧＩＢＣＯ，７４３７９４），青、链 霉 素 终 浓 度 均为１００Ｕ／ｍＬ。 分 化 培 养 基：完 全 培 养 基 内 加 入 终浓 度 为 １０μｇ／ｍＬ 胰 岛 素 （ＩＮＳ，Ｓｉｇｍａ，Ｉ５５００）， １．０μｍｏｌ／Ｌ 地 塞 米 松 （ＤＥＸ，Ｓｉｇｍａ，Ｄ１７５６），０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ３－异 丁 基－１－甲 基 黄 嘌 呤 （ＩＢＭＸ，Ｓｉｇｍａ， １７０１８）。１ｍｇ／ｍＬⅠ 型 胶 原 酶 消 化 液：２５ ｍｇⅠ 型 胶原酶（Ｓｉｇｍａ，Ｃ０１３０），０．２５ｇ 牛 血 清 白 蛋 白，２５ ｍＬ ＰＢＳ溶解。０．２５％ 胰 蛋 白 酶 消 化 液：０．２５ｇ 胰 蛋白酶（Ｓｉｇｍａ，１∶２５０）溶于１００ｍＬ ＰＢＳ中。 上述 溶液均需调整 ｐＨ 值 至 ７．２～７．４，０．２２μｍ 微 孔 滤 膜正压过滤除菌，分装后置于 －２０ ℃保存。油红 Ｏ 工作液：０．７ｇ油红 Ｏ，溶于２００ ｍＬ 异丙醇中，室温 静置过夜，分析滤纸过滤，滤液加 入 １５０ ｍＬ 灭 菌 蒸 馏水，４ ℃静置过夜，过 滤 ２ 次 后 室 温 储 存。ＤＫＺ－２ 型恒 温 水 浴 箱 （上 海 精 安 实 验 仪 器 厂 ） ；ＦＯＲ－ ＭＡ３１１１型 ＣＯ２ 恒 温 培 养 箱 （Ｔｈｅｒｍｏ 公 司 ）；Ｌｅｉ－ ｃａＤＭＩ３０００Ｍ 型倒置显 微 镜 （浙 江 省 科 学 器 材 进 出 口有限责任 公 司）；７２２ 型 分 光 光 度 计 （上 海 市 光 棱 技 术 有 限 公 司 ）。
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石 河 子 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ） 第 ２９ 卷
后改善本地绵羊肌 内 脂 肪 含 量、改 善 羊 肉 品 质 奠 定
基础。
１ 材Fra Baidu bibliotek与方法
１．１ 材 料
１．１．１ 组 织 来 源 于石 河 子 市 活 畜 屠 宰 场 选 取 健 康 绵 羊 １ 只，快
Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｖｉｎｅ Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ Ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ
ＬＵＯ Ｙａｎ，ＺＨＡＯ Ｚｏｎｇｓｈｅｎｇ，ＧＵ Ｘｉｎｌｉ，ＳＨＡＯ Ｙｏｎｇｂｉｎ，ＳＨＩ Ｍｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ ８３２００３，Ｃｈｉｎａ）
每 隔 ２ｄ 换 液 １ 次 。 １．２．１．２ 单 层 细 胞 培 养 法
取 材 及 洗 涤 同 组 织 块 培 养 法 ；将０．５～１．０ ｍｍ３ 的组 织 小 块 移 入 离 心 管 中，含 双 抗 的 ＰＢＳ 漂 洗 数 次，加入 ５ 倍 体 积 的 １ ｍｇ／ｍＬⅠ 型 胶 原 酶 消 化 液， 密封管口，置于３７ ℃恒温水浴箱中消化１ｈ（每隔 ３ ｍｉｎ摇动１次）；加 入 完 全 培 养 基 终 止 消 化，不 锈 钢 细胞 筛 过 滤，收 集 滤 液 于 另 一 离 心 管 中，１０００ｒ／ ｍｉｎ，８ｍｉｎ；细胞沉淀 经 基 础 培 养 液 漂 洗 ２ 次，完 全 培养液吹打 制 成 细 胞 悬 液；计 数，调 整 细 胞 密 度 至 １．０×１０５ 个／ｍＬ，接 种 于 ２５ｃｍ２ 培 养 瓶 中，３７ ℃、 ５％ ＣＯ２ 培 养 箱 中 静 置 培 养，２４ｈ 后 换 液 以 除 去 血 细 胞 和 未 贴 壁 细 胞 ，之 后 每 隔 ２～３ｄ 换 液 １ 次 。 １．２．２ 绵 羊 肌 内 前 体 脂 肪 细 胞 的 传 代 培 养 ［５］
第 ２９ 卷 第 ３ 期 ２０１１ 年 ６ 月
石 河 子 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｉｈｅｚｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
文 章 编 号 ：１００７－７３８３（２０１１）０３－０２９１－０５
Ｖｏｌ．２９ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０１１
作 者 简 介 ：罗燕（１９７８－），女，讲师，博士生，从事中药及中药药理研究、动物遗传育种与繁殖研究；ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｂｌｙ２００６＠１６３．ｃｏｍ。 通 讯 作 者 ：赵 宗 胜 （１９６９－），男 ，副 教 授 ，博 士 ，从 事 动 物 分 子 遗 传 与 生 物 新 技 术 研 究 ；ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｚｏｎｇｓｈ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｏｖｉｎｅ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅｐ－ ｏｓｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｆａｔ，ｔｈｅ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｈｅｅｐ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｔｒａｍｕｓ－ ｃｕｌａｒ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ，ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｔａｉｎｅｄ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｌｉｐｉｄ ｗｉｔｈ ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ，ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｆｒｏｍ ｅｘｐｌａｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ａ ｓｈｏｒｔ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｃｏｎ－ ｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｅｅｄ ｐｒｅｓｅｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｈｅｅｐ ｗｈｉｃｈ ａｉｄｅｄ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｍｕｔｔｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｖｉｎｅ；ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ；ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ；ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ
１．２ 方 法
１．２．１ 绵 羊 肌 内 前 体 脂 肪 细 胞 的 原 代 培 养 ［４］ １．２．１．１ 组 织 块 培 养 法
脂肪组织用 ＰＢＳ（含 青 霉 素、链 霉 素 各 ４００ Ｕ／ ｍＬ）漂洗５次，仔细剔除 血 管 和 结 缔 组 织，剪 成 ０．５ ～１．０ｍｍ３ 的 小 块，置 于 无 菌 培 养 皿 中，加 入 少 量 完 全 培 养 液 悬 浮 组 织 小 块 ；用 吸 管 分 次 吸 取 组 织 块 ， 将其均 匀 贴 附 于 培 养 皿 底 壁 上，置 ３７ ℃、５％ ＣＯ２ 培养箱中约 ４ｈ，待 组 织 块 牢 固 粘 附 于 培 养 皿 底 壁 后，加适量完全培养液浸泡组织块，静置培养 ３ｄ；３ ｄ后补加或更换培养液，并吸出漂浮的 组 织 块；之 后
及 其 影 响 因 素 的 研 究 ，具 有 非 常 重 要 的 意 义 。 前体脂肪细胞的体外培养不仅能完整地认识脂
肪组织发生和增生的全过程，并且可以直接观察各种 因素 对 这 个 过 程 的 调 控。 目 前，国 内 已 经 建 立 了 猪［２－３］、牛［４－５］前体脂 肪 细 胞 原 代 和 传 代 培 养 模 型，取 材部位有皮下 、肌 内 和 网 膜 脂 肪 组 织 等 ，但 目 前 有 关 绵羊肌内前体脂肪细胞培养体系的建立还未见报道。
原代细胞培养至８０％～９０％ 汇 合 时，弃 去 培 养 液，ＰＢＳ涮洗２ 遍，０．２５％ 胰 蛋 白 酶 消 化 液 在 ３７℃ 下消化２～３ｍｉｎ，显微镜 下 观 察 细 胞 形 态 回 缩 并 有 个 别 细 胞 飘 起 时 ，弃 去 消 化 液 ，加 入 完 全 培 养 液 终 止 消化，吹 打 成 细 胞 悬 液，按 １∶３ 或 １∶４ 的 比 例 进 行 传代接种培养，标记为 Ｐ１（第１ 代）。传代培养过程 中，每２～３ｄ换 １ 次 完 全 培 养 液，直 至 细 胞 汇 合 并 铺 满 整 个 培 养 皿 后 ，再 重 复 上 述 操 作 继 续 传 代 。 １．２．３ 细 胞 生 长 曲 线 的 测 定 ［６］