T细胞体外培养

目前应用于临床的治疗的T细胞有如下几种：

1、CD3AK细胞

CD3AK细胞全称为抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞，当淋巴细胞与抗CD3单克隆抗体共育2-3天，淋巴细胞可以明显增殖，此种激活为一次性完成，淋巴细胞一经激活即无需抗CD3单克隆抗体持续存在而发挥作用。只会在加入低剂量的IL-2继续培养即可维持起活跃增殖，经2-3周培养后可获得大量的表现为CD3+、CD4以及CD8+的混合体，且随时间延长，CD3+和CD8+双阳性细胞的比例增加，而CD4+和CD8+双阳性的比例则下降。因此，CD3AK细胞在表型上似乎接近于CTL。

具体培养方法:

1、培养前1天以含CD3Ab 5 mg／L的磷酸盐缓冲液

(PBS)20 ml平铺培养瓶，4℃过夜包被；

2、培养第1天弃去PBS，以PBS冲洗2 次及1640培养液

冲洗1次，加入1 000 U／ml的 IFN-γ，置于37℃体积分数为5％C02的饱和湿度培养箱中；

3、24小时后加入1 000 U／ml的lL-2。

4、继续培养

2、CIK细胞

CIK细胞的全称为细胞因子活化的杀伤细胞，它是在多种细胞因子（IFN-γ，CD3单抗，CD28单抗，IL-2和IL-1）作用下，外周血单核细胞可以被定向诱导并大量增殖成为具有抗肿瘤活性的细胞群。CIK细胞的表型主要为CD3+CD56+,是来源于PBMC中的T细胞（CD3+CD56-）。

具体培养方法：

3、LAK细胞

LAK细胞全称为淋巴因子激活的杀伤细胞，可在外周血单核细（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异的杀伤细胞，称为LAK细胞。LAK细胞的前体细胞是NK细胞和T细胞。

4、TIL细胞

TIL细胞的全称为肿瘤浸润淋巴细胞。它的制备方法与LAK细胞相似，所不同的是TIL的细胞来源是肿瘤组织中分离的浸润淋巴细胞，用少量的IL-2细胞刺激后，能大量扩增表型为CD4+及CD8+为主的T细胞。

外周血单核细胞（PBMC）分离实验

血标本：EDTA（2%）盐抗凝血：采集后可4度保存不超过半天，尽量早处理。10ml抗凝血分2份（分离淋巴细胞可稍多）。

外周血单核细胞（PBMC）分离步骤：

1.吸出10ml新鲜抗凝血（含2%EDTA）至50ml离心管中，加入

10mlPBS混匀，此时共20ml；

2.2个50ml离心管内分别加入10ml外周血单核细胞（PBMC）分离

分层液；

3.向装有分层液的50ml的离心管分别加入10ml稀释样品，注意缓

慢加入，不要冲破液面，2000r/min离心20分钟；

4.巴氏管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一个离心管

中，避免吸入分层液和血浆（2管混入一个离心管）；

5.加入5ml PBS，1800r/min离心5分钟；

6.弃上清，取沉淀，再次加入5mlPBS混匀成细胞悬液，

1000r/min离心5分钟，弃去上清，保留沉淀;

7.2ml 1640 培养基重悬后移至培养瓶中培养

需要购买的试剂：外周血淋巴细胞分离液、anti-CD3抗体、IL-2、IL-1、IFN-γ。