2.1 体外培养细胞的分类

细胞工程体外培养细胞的分类

体外培养细胞的分类

按生长方式

贴壁型细胞（Monolayer cells）

悬浮型细胞（Suspension cells）

绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。按细胞形态(贴壁细胞）

成纤维型细胞（Fibroblast-liked cells）

上皮型细胞（Epithelium-liked cells）

其它，不定型

体外细

胞生长

贴壁型

悬浮型

多形型细胞（神经元和神经胶质细胞

，呈多角形）

上皮细胞型（上皮、肝、胰和肺泡上

皮等，源于外胚层和内胚层细胞）

成纤维细胞型（心肌、平滑肌、血

管内皮等，源于中胚层细胞）

游走细胞型（单核细胞、巨噬细胞

和某些肿瘤细胞，形状不定）

生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤细胞

贴壁型生长细胞

处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。

如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。

成纤维型细胞

胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞

质向外伸出2-3 个长短不同

的突起，细胞呈放射状、火

焰状或漩涡状生长。

上皮型细胞

胞体呈扁平不规则多角形，中有圆形

核，细胞紧密相连成

单层膜。

游走型细胞

在支持物上散在生长，胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，运动速度快而不规则，细胞形态不稳定，有时难以与其他型细胞相区别。

多形型细胞

由于难以确定其形态而得名。

悬浮型生长细胞由于悬浮在培养液中生长，

生存空间大，可维持对数生长期，也允许长时间生长，传代繁殖方便，能繁殖更多细胞，饱和度大，可达高密度，适合大量生产，有

工业应用价值。

传代时只需稀释，无需消化

处理，易于收获，便于做细胞代

谢等研究。

习题

1.体外培养细胞分那几类？

2.贴壁型细胞生长有什么特点？

3.悬浮型细胞生长有什么特点？

胚胎干细胞培养有新法

胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试

干细胞临床试验研究管理办法(试行)

附件1 干细胞临床试验研究管理办法（试行）（征求意见稿）第一章总则第一条为保证干细胞临床试验研究过程规范，结果科学可靠，保护受试者的权益并保障其安全，根据《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》和《药物临床试验质量管理规范》等相关法律法规，制定本办法。第二条本办法所指干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞临床试验研究，是指在临床前研究基础上，应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后回输（或植入）人体，用于疾病预防和治疗的临床试验研究。这种体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、修饰、干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存及冻存后的复苏等过程。用于干细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导的多能性干细胞。成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织，以及发育相伴随的组织（如脐带、羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。第三条干细胞临床试验研究必须具备充分的科学依据，其预防和治疗疾病的预期优于现有的手段，或用于尚无

有效干预措施的疾病，优先考虑威胁生命和严重影响生存质量的重大疾病，以及重大医疗卫生需求。第四条干细胞临床试验研究必须在干细胞临床研究基地进行，干细胞临床试验研究基地由卫生部和国家食品药品监督管理局组织进行遴选和确定。第五条干细胞临床试验研究基地（法人单位）是干细胞临床试验研究的责任主体。申报单位对干细胞制剂质量及相关研究活动负责。第六条干细胞临床试验研究应当按照《药物临床试验质量管理规范》要求，遵守以下原则：（一）符合临床试验研究伦理原则，保护受试者、捐献者生命健康权益；（二）符合技术安全性、有效性原则，即风险最小化；（三）符合干细胞制剂质量要求的原则；（四）认真履行有效知情同意的原则；（五）有益于促进公众健康的原则；（六）干细胞临床试验研究透明化原则；（七）保护个人隐私的原则。第七条开展干细胞临床试验研究，不得向受试者收取费用，不得市场化运作,不得发布干细胞治疗广告。

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。参考文献　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。贮存液 DMEM（高糖）马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。冻存细胞冻存液

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养的优缺点优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。一、体外细胞培养条件（一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室（二）、体外培养的设备和器具设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿（4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网（三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等

干细胞知识产品手册

干细胞知识小册子一、干细胞的美好未来二、干细胞-------神奇的“万能细胞” 三、干细胞衰老与疾病的发生四、干细胞与疾病的治疗五、干细胞与抗衰老六、干细胞--无创逆龄，定格青春七、Q＆A 一、干细胞的美好未来 2017年8月27日，湖南卫视原创科技栏目《我是未来》邀请干细胞领域大咖、中国科学院广州生物医药与健康研究院院长裴端卿教授等嘉宾，聚焦干细胞技术的发展及应用，为大家带来了一次生动趣味的生命科技知识科普。节目中，裴端卿教授以浅显易懂的语言，向大家着重介绍了什么是干细胞，干细胞的作用以及未来能给人类带来哪些前所未有的变化，让我们见识到了科学技术的发展带给生命的无限可能性。人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来！ 1、细胞衰弱老化---衰老和死亡的真相我们的身体是由数十万亿（40-60万亿）亿细胞构成的，随着时间的迁移，我们人体里面的细胞开始老化，这个衰老的过程，会使器官与组织在功能上的衰退，导致机体的死亡。生命的起始从受精卵的分裂形成开始，胚胎干细胞分化发育成身体的各个组织器官，随着时间的迁移，胚胎干细胞彻底消失，人体内的干细胞种类只有成体干细胞。成体干细胞的最大作用就是在机体受到损伤时进行修复，替代凋亡的组织细胞。随着年龄的增长，成体干细胞的功能慢慢丧失，数量也逐渐减少，到最后完全消失，生命也就走向了终点。 2、干细胞——“长生不老”的秘诀所谓干细胞，就是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生人体各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

随着时间的迁移，人体细胞会开始老化，而衰老的过程会造成器官与组织在功能上的衰退，那么延缓细胞的衰老出发点就是干细胞，干细胞是生命的起源细胞。大量科学研究发现，干细胞的分化是一个可逆的过程，如果人体细胞能够逆转到干细胞的水平，那么人类的寿命将得以延长。 3、干细胞——再生医学的源泉除了延长寿命，干细胞还可以培育和再生器官，这就意味着当人们身体的某一器官出现了问题，都可以用再生器官进行替换。利用干细胞具有的向机体其他细胞分化转变的潜在能力，再生性和再造性地修复各种变性、坏死性、损伤性、代谢性和退行性病变，恢复病损或退化组织器官结构和功能的一系列临床干细胞移植治疗技术和再生保健技术被称为再生医学。通俗理解，再生医学就是让人类的组织或器官再生。节目现场，教授们展示了由诱导多能干细胞培育出来的牙齿组织，现场的每一位观众都惊叹不已。教授们表示，目前我们可以通过牙齿的再生来了解细胞如何变成组织、组织又怎样变成器官，将来再发展到诸如肝脏的再生、肾脏的再生等等，可以在临床上得到应用。他们认为当拥有这些技术之后，人们未来都可以活到100岁，120岁，150岁，200岁……这些都是干细胞带给我们的未来。 4、我们没有理由质疑美好的未来干细胞技术是攻克传统医学所不能及的重大疾病的一种全新医疗技术，是当今和未来再生医学的研究热点和发展方向，已被列入“人类十大科技进展”之首和国家重大科技专项。科学给予人们希望，而这种希望又不断激励着人们追求更美好的生活。随着科学界对于干细胞领域的深入研究，未来干细胞在治疗疾病与健康保障方面将有更大的作为。干细胞领域研究的不断前进将为人类带来更加美好的未来。二、干细胞-------神奇的“万用细胞” 干细胞具有再生各种组织器官潜在功能，所以，其在医学界又被称为“万用细胞”。也正是因为干细胞这一特点，使其成为了21 世纪再生医学的基础，更是成为当前科技的前沿和热点。理论上来讲，干细胞可用于多种疾病的治疗，如糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。也正是干细胞这种潜在的价值，引起了各国学者研究探索的兴趣。

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

胚胎干细胞培养SOP

胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP) 一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。培养基 ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤

干细胞临床试验研究项目管理办法试行实施细则

干细胞临床研究管理办法（试行）第一章总则第一条为规范和促进干细胞临床研究，依照《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》等法律法规，制定本办法。第二条本办法适用于在医疗机构开展的干细胞临床研究。干细胞临床研究指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病预防或治疗的临床研究。体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、诱导分化、冻存及复苏等，不包括基因水平的操作。第三条干细胞临床研究必须遵循科学、规范、公开、符合伦理、充分保护受试者权益的原则。第四条开展干细胞临床研究的医疗机构（以下简称机构）是干细胞制剂和临床研究质量管理的责任主体。机构应当对干细胞临床研究项目进行立项审查、登记备案和过程监管，并对干细胞制剂制备和临床研究全过程进行质量管理和风险管控。第五条国家卫生计生委与国家食品药品监管总局负责干细胞临床研究政策制定和宏观管理，组织制定和发布干

细胞临床研究相关规定、技术指南和规范，协调督导、检查机构干细胞制剂和临床研究管理体制机制建设和风险管控措施，促进干细胞临床研究健康、有序发展;共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会，为干细胞临床研究规范管理提供技术支撑和伦理指导。省级卫生计生行政部门与省级食品药品监管部门负责行政区域内干细胞临床研究的日常监督管理，对机构干细胞制剂和临床研究质量以及风险管控情况进行检查，发现问题和存在风险时及时督促机构采取有效处理措施;根据工作需要共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会。第六条机构不得向受试者收取干细胞临床研究相关费用，不得发布或变相发布干细胞临床研究广告。第二章机构的条件与职责第七条干细胞临床研究机构应当具备以下条件：（一）三级甲等医院，具有与所开展干细胞临床研究相应的诊疗科目。（二）依法获得相关专业的药物临床试验机构资格。（三）具有较强的医疗、教学和科研综合能力，承担干细胞研究领域重大研究项目，且具有相对稳定、充分的项目研究经费支持。（四）具备完整的干细胞质量控制条件、全面的干细胞临床研究质量管理体系和独立的干细胞临床研究质量保证

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园一、原代细胞培养原理原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个吸管若干支酒精灯原代细胞培养方法三、胰酶消化法（1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。（2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

2020年中国的生命科学(干细胞篇)

2020年中国的生命科学（干细胞篇）【字体：大中小】https://www.360docs.net/doc/1812712023.html, 时间：2010年1月18日0 来源：生物通 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 摘要：以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。生物通报道，以10年作为一个周期展望未来正在流行，正值2010年，21世纪的头10年刚过去，这10年中国不仅经济取得巨大的发展，生命科学也精彩无比，然而这只是生命科学精彩序幕的开始，更精彩的演绎且看下个10年。无论是经济、国防甚至是科技领域，不少来自国外的声音都提出中国将称霸的口号！正如笔者不久前看的一篇警世文章中提及的一般，看GDP不能仅看数量，更应该看质量，我们看到中国这些年在科学领域SCI文章的数量的同时也该看到质量，具体就不赘述（有兴趣请看上一篇文章：2020年中国的生命科学世界）。本篇文章我们将谈谈2020年中国可能在生命科学哪些领域取得可观的成绩。干细胞为什么干细胞要放在第一个谈呢？不可否认地，干细胞是目前基础研究、再生医学研究领域中最热门的话题。就连对生命伦理要求严苛的美国、欧洲各国都忍不住克服重重阻碍，企图在干细胞研究领域取得长足的发展。

从美国解禁胚胎干细胞研究，到NIH批准多株胚胎干细胞系成为合法研究株可窥见一斑，更有甚者，不少科学家认为如果再不解禁，美国可能在干细胞领域失去第一的地位，在科技发展日新月异的年代，再要追赶恐怕望尘莫及。此外，美国不仅在基础研究方面解禁了胚胎干细胞，在临床上，2009年FDA 批准了2个临床胚胎干细胞试验开展计划。这些都说明，美国在胚胎干细胞领域准备大展拳脚。除了传统的胚胎干细胞，干细胞领域还包括一种可规避伦理问题的新领域：iPS（诱导多能干细胞）。iPS创始人之一James Thomason就是来自美国威斯康辛大学麦迪逊分校的。这个只用成体细胞就能诱导类胚胎干细胞的技术成为干细胞领域的新星。中国的2020年干细胞领域的重要性不言而喻，如果你留意，看看2009年新立项的973及重大研究项目名单就能发现问题。在2009年973项目中，干细胞领域就是立项最多的一个。“973计划”，意味着国家重点基础研究规划项目。每次期限为5年，从2010年到2020年的这头5年，干细胞就占有举足轻重的地位，不难想象2020年，干细胞一定会取得长足的发展。基础研究方面北大的邓宏魁教授，广州生物医学与健康研究院的裴端卿教授，中科院动物所的周琪教授，NIBS的高绍荣教授等等，这些干细胞领域内的前沿科研工作者在2008年、2009年已经取得了不错的科研成绩。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs

人胚胎干细胞培养手册

人胚胎干细胞培养手册操作指南运输和保存：人胚胎干细胞（hESCs）和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中，hESCs 4×105/管，可接种一个3.5cm培养皿（或六孔板的一个孔），PMEFi 4×106/管，可接种一块六孔板。冻存管用干冰运输，收到后，hESCs投入液氮，PMEFi放入－80℃保存。培养条件：温度：37±0.5℃ CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100% 主要技术： 1．细胞培养：当进行hESC培养时，总的培养原则必需遵守，所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。此外，通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。当接触和细胞有关的一切试剂和材料时，应该带手套（包括开冰箱门）。工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。 2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2μm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。 3．细胞处理为了便于操作，最好不要同时处理两个以上的标本。操作时，在室温和低CO2的时间不要太长。所有的细胞离心：室温，500－600g，5分钟。

培养液准备： MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行，完成后用0.2μm的滤膜过滤。当准备hESCs培养液时，保持一致性很重要。如有可能，尽量使用相同的试剂。使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。生长因子应该最后添加，需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体，在少量培养液中不要试图重悬它。 MEF培养液： hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2μm的滤膜过滤,4℃保存。明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液，加热确保明胶完全溶解，使用前高压或0.2μm 的滤膜过滤。明胶包被：接种细胞前，用0.1％明胶溶液包被培养皿，37℃至少30分钟，分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。在接种MEF前吸除明胶溶液。

人脂肪干细胞(ADSCs)体外培养的研究及应用进展

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/1812712023.html, 人脂肪干细胞（ADSCs）体外培养的研究及应用进展作者：徐巧瑜等来源：《中国美容医学》2012年第13期干细胞是一类具有自我更新与增殖能力的细胞，按其分化阶段不同分为胚胎干细胞与成体干细胞，目前对成体干细胞的研究较为广泛。人的脂肪干细胞（adipase derived stem cells，ADSCs）是来源于脂肪组织的干细胞，具有自我更新及多向分化的能力，在适宜诱导条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。自从2001年ZUK[1]首次通过吸脂术抽取脂肪组织悬液培养出多能干细胞，ADSCs因其取材方便，一次取材获取的细胞数量大，对供体创伤小等优点已成为近年来种子细胞的研究热点。 1 ADSCs的获取脂肪组织是人体中含量最丰富的组织，占正常体重的10%～29%[2]。它的存在主要有两种形式：棕色脂肪组织及白色脂肪组织。其中棕色脂肪组织仅在婴儿期发挥作用，而白色脂肪组织在人体起到储存及释放能量的调节器作用，主要分布在腹腔内的网膜、肠、肾周及臀部、大腿、腹部的皮下区域[3]。因此研究重点集中在白色脂肪组织。目前，ADSCs主要通过局部脂肪切除术及抽脂术后的脂肪组织中获取，但Vallee等[4]发现由抽脂术获得的脂肪有更好的成脂潜力、重建三维脂肪替代物能力。供者的年龄也是影响ADSCs的因素。一般来说供者的年龄越小，细胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]却认为ADSCs的衰老与供体的体质指数呈负相关，而与年龄无关。取材部位不同，ADSCs数量凋亡倾向也不同。Schipper等[6]发现人前臂脂肪组织中含有更多的脂肪干细胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于获取ADSCs[7]。 2 ADSCs分离培养 2.1分离：目前常用的是酶消化法，将脂肪组织剪碎后采用胶原酶或胰酶消化、过滤离心后，使用含血清的培养基将沉淀重悬后接种于培养瓶中。沉淀物是多种细胞的混合物，又称为血管基质成分（Stromal vascular fraction，SVF），其中含有内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、间充质干细胞及血液来源的细胞，常需传代来纯化。 2.2 培养：体外培养需要合适的生长条件，培养基的选择很重要。常用的培养基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]报道L-DMEM比a-MEM更适合培养ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于维持ADSC的多分化潜能，而培养液中的抗生素对ADSC 的细胞表型和分化能力无影响。Bunnell等[10]认为25%血清浓度可能使ADSC向脂肪细胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。对于最优的糖浓度及血清浓度尚不明确。为了消除动物血清的使用带来的不良影响，部分文献开始介绍低人血清培养基或无血清培养基的使用。

干细胞保健产品手册.doc

肌体抗衰产品说明一、概述安徽安龙科技有限公司（以下简称“安龙基因”）是清华大学施一公院士的支持下，由安龙生命科学基金和清华大学医学院共同成立的高科技生物医药企业。依托清华大学医学院强大的技术力量和平台优势，安龙基因已开发完成一系列应用于临床检测、疾病风险评估以及细胞保健等产品。2015年始，先后成立了北京安龙、安徽安龙、银川安龙、重庆安龙、潍坊安龙、安龙临检和安龙智造等分支机构，逐步开启全国化产业链布局。二、干细胞产品名称：肌体抗衰产品人体的衰老，主要是因为组织细胞的老化而导致器官功能的衰退。脐带间充质干细胞具有神奇的定向分化和自我增殖能力，随血液到达全身各器官后，即可分化成相应新的组织细胞并更新衰老的细胞，恢复身体机能从而达到抗衰老的效果。功效主要表现为抗衰功能，具体如下表所示

三、产品说明脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs） 1 产品简介脐带为连接胎儿和胎盘的管状结构，是胎儿和母体的血液间进行CO2和O2交换、代谢废物和营养物质交换的通道，同时一些激素和抗体等也通过脐带从母体传递给胎儿。脐带在羊膜包裹着的脐动脉、脐静脉之间充满着的疏松、凝胶状的黏膜组织，被称为华通氏胶。脐带间充质干细胞可由华通氏胶洗脱、分离出来。 2 产品特性（1）可塑性：具有多能干性，在特定条件下，能直接参与组织器官的损伤修复和功能恢复。（2）旁分泌作用：能改善损伤处微环境，促进神经细胞的再生及修复，调节细胞免疫生物学活性。（3）无免疫排斥，移植无需配型。（4）脐带属于新生儿产后废弃物，没有伦理学问题。 3 脐带间充质干细胞的优点（1）原始祖性相对更接近于胚胎干细胞，具备较强的增殖分化能力（2）较易于分离，相对数量较多，纯化度较高（3）没有潜伏性病毒和病原微生物污染（4）体外扩增时培养体系能够统一，利于质控，也可制成冷冻种子细胞 4 产品技术优势（1）运用自主研发的UC-MSCs细胞培养体系，一周内细胞可达5×107以上（2）体外增殖严格控制在4代以内四、适应人群 1.亚健康、高压力人群 2.预防衰老，维持机体年轻化的人群 3.免疫能力下降的人群 4.内分泌紊乱及性功能衰退人群 5.心血管系统功能退变人群 6.内脏器官功能退化人群 7.器官功能衰退骨骼运动系统退变人群五、禁忌人群 1.高度过敏体质或者有严重过敏史者 2.休克或多脏器功能衰竭者 3.恶性肿瘤患者 4.全身感染或局部严重感染者 5.传染病患者 6.染色体或基因缺陷者 7.怀孕期、哺乳期的妇女