细胞体外培养的基本方法和过程

二、体外培养的ຫໍສະໝຸດ Baidu本方法和过程
（一）原代培养（primary culture） １、取材及培养材料的制备 ２、分离（散）细胞的方法 ３、接种与培养过程 ４、更换培养液
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
１、取材及培养材料的制备： （1）准备工作：
主要是取材器具、用品的灭菌以及实验者、实验动 物的清洁与消毒。
分离（散）细胞［isolated（dissociated）cell］： 由组织块分散后制成的单个细胞一般称之～。
细胞悬液（cell suspension）： 单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶 液中，就称之～ 。
二、体外培养的基本方法和过程
几个名词和概念：
当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时 候，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就 需要将培养物分成若干小的部分，继续培养。
细胞体外培养的基本方法和过 程
细胞体外培养的基本方法和过 程
课程安排及进度
实验课时间：从第14周开始 实验课地点：104馆三楼东边
注意事项：
1.网上没有名字的 同学请不要填报实 验课名单。
2.现在不能确定 自己时间的同学 不要填报，可以 下次上课时再报。
3.一旦填报就不能 再更改时间。
体外培养的基本原理与技术
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
１、取材及培养材料的制备：
关于取材：
（1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在 这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个 体外培养过程就很难达到预期的目的。
(2)关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织 的取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中， 还需要根据具体的实验情况做一些调整。
一、从体内生存环境到体外生长条件 二、体外培养的基本方法和过程 三、体外培养物的生长生物学 四、细胞分离与纯化 五、细胞系（株）、细胞克隆 六、培养物的观察检测方法
二、体外培养的基本方法和过程
几个名词和概念：
植块（explant） ： 从动物体内取出，用于培养的小块组织一般称为外植块或 简称植块。
因此，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养， 而将体外培养分为原代培养或称初代培养（primary culture） 和继代培养（secondary culture)或称再培养（subculture） 两大类。
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养 （二）继代培养 （三）体外培养的基本方法和技术 （四）培养物的冻存与复苏 （五）培养物的污染
（2）制备基本步骤（技术路线）：
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
（2）基本步骤（技术路线）：
大块组织
洗去血污
剔除多余成分
切成约1mm3大小的植块 植块培养
• 将所取组织剪碎 • 蛋白酶溶液消化 • 机械方法吹打组织块 • 不锈钢网筛过滤 • 过滤液离心 • 用培养液悬浮成细胞悬液 • 计数并调节细胞密度 • 培养分离的细胞
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
③原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液， 也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法， 即便在换液过程中更换培养器皿，但不更换培养组织细胞所 附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；
④植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培 养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再 培养。
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养 物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培 养过程。
原代培养的概念包含以下几方面含义： ①原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到 培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生 长器皿； ②原代培养中的“代”并不是指细胞的“代”数，原代 培养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反， 在原代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞 分裂活动而产生多个子代细胞；
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
３、接种与培养过程
接种（seeding）也称种植(plating)或体外移植 (explantation),实际上就是将取材并切割好的组织块（植 块）或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。
如果将准备好的植块（包括器官型植块）接种并进行培 养，就称为植块培养。体外移植的称谓较多用于植块培养的 情况。
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture） １、取材及培养材料的制备 ２、分离（散）细胞的方法 ３、接种与培养过程 ４、更换培养液
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
２、分离（散）细胞的方法：
（1）机械解离细胞法：
1）吸管吹打法-2）过筛法--
（2）酶学解离细胞法：
1）胰蛋白酶离解细胞法-2）胶原酶离解细胞法--
（3）螯合剂解离细胞法：
常用螯合剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）、 柠檬酸钠、 枸橼酸钠。
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture） １、取材及培养材料的制备 ２、分离（散）细胞的方法 ３、接种与培养过程 ４、更换培养液
如果所培养的细胞没有贴壁依赖性，在悬浮状态下即可 以生长和繁殖，这样的培养方式就称为悬浮（细胞）培养 （suspension culture）。
如果将所制备的细胞悬液用于种植和培养，就称为分离 （散）细胞培养。
二、体外培养的基本方法和过程
（一）原代培养（primary culture）
３、接种与培养过程
分离（散）细胞培养的细胞如果属于贴壁依赖型细胞， 在培养瓶皿中必须黏附于一定的生长基质表面才能生长，这 样的细胞一般只能在培养瓶皿表面长满一层，当培养物长满 培养器皿的表面时即会因为接触抑制而停止生长，这种培养 方式就称为单层细胞培养（single-layer cell culture)。