体外培养细胞的种类和命名
细胞工程名词
细胞工程名词解释细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。
动物细胞培养（animal cell culture）：是指从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞后，模拟动物体内的生理条件，在体外无菌、适当的温度、湿度、酸碱度、气体环境及一定营养条件下，使其不断地生长、增殖并维持其正常的结构和功能的一种技术。
动物器官培养（organ culture）：是指对离体的整个器官、器官芽基或器官的一部分进行体外培养，构成器官的不同组织仍保持着它们原来的结构与功能，因而培养的器官在结构、功能上与体内相应的器官非常相近。
动物组织培养（tissue culture）：是指取自动物体的某种组织，不经细胞分散处理，对组织团块直接进行体外培养，组织中的细胞与其邻近的细胞、细胞外基质仍然保持着原本的联系，且细胞一直保持原本已分化的特征，组织的结构和功能在培养过程中无明显的变化。
原代培养（primary culture）：从有机体取得的材料（细胞、组织或器官）在培养容器培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。
汇合（confluent）：指在培养容器中培养的细胞彼此汇合形成单层。
接触抑制(contact inhibition)：体外培养的正常动物细胞，在生长过程中达到相互接触时停止分裂和运动的现象。
外植快（explant）：用于初始体外培养而切下的一小块组织或器官。
传代（passage）：将细胞从一个培养容器移植到另一个培养容器中，也称为传代培养或再培养（subculture）。
细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。
如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系（finite cell line)。
细胞名词解释
细胞名词解释1.愈伤组织：原意是指植物体的局部受创伤刺激后，在其伤⼝表⾯新⽣的⼀团薄壁细胞。
在组织培养中是指在⼈⼯培养基上由已经分化的外植体的细胞重新分裂⽣长⽽形成的⼀团⽆特定形状、⽆序⽣长的薄壁细胞。
在⼀定条件下离体状态的植物组织中已经分化并停⽌⽣长的细胞重新分裂⽣长所形成的⽆组织结构的细胞团。
2.外植体：指植物组织培养中作为培养材料的离体组织块离体器官或离体细胞。
3.胚状体：由外植体或愈伤组织产⽣的与正常受精卵发育成的胚相类似的胚胎状结构。
据来源分为体细胞胚与⽣殖细胞胚。
4.极性：⾼等植物均具⼀主轴，各器官沿此主轴有顺序的进⾏⽣长分化。
主轴的⾸尾两端在⽣理形态上都有着明显差异，通常⾸段⽣芽尾端长根（形态学上端下端）这种现象叫极性。
5.植株再⽣：指通过组织培养技术将植物的细胞、组织、器官等培养成完整植株的过程。
6.形态发⽣（形态建成）：指⽣物个体发育或再⽣过程中⽣物体及其器官的形态结构的形成过程。
7.试管苗：指在⽆菌离体条件下的⼈⼯培养基上对植物细胞、组织或器官进⾏培养所获得的再⽣植株。
8.玻璃苗：指外表呈玻璃状，幼茎、叶⽚呈现半透明⽔渍状态的畸形试管植物。
9.体细胞⽆性系：指由同⼀个外植体反复进⾏继代培养后得到的⼀系列后代。
在细胞培养中，由单细胞形成的后代叫但细胞⽆性系。
10.培养基：⽤于满⾜植物正常发育所需各种营养物质的总和。
11.初代培养：指从植物体上分离外植体进⾏的第⼀次培养。
12.继代培养：将初代培养的培养物（愈伤组织、芽等）重新切割转移到新的培养基上继续扩⼤培养的过程。
13.固体培养：指加⼊琼脂等固化剂使培养基呈固体状态所进⾏的培养。
14.液体培养：指不加Agar等固化剂使培养基呈液体状态所进⾏的培养。
U11、细胞⼯程：按照⼀定的设计⽅案，通过在细胞、亚细胞或组织⽔平上进⾏实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性⽣物⼯程。
2、摇床：常⽤来进⾏细胞悬浮培养，可根据震荡⽅式分为⽔平往复式和回旋式两种，震荡速度因培养材料和培养⽬的的不同⽽不同，常⽤的震荡速度为100r/min.3、培养瓶：⼀般的植物组织和细胞培养常⽤玻璃三⾓瓶、试管、各种⼤⼩的⼴⼝玻璃瓶时，有时甚⾄⽜奶瓶和罐头瓶也都可以利⽤，特别是在进⾏快速繁殖时更常⽤造价较低的培养器⽫。
细胞培养技术 第一章 绪论和基本理论
第二节 生存环境、条件
一、无污染环境：首要条件
二、温度 36.5℃±0.5℃（36℃~37℃）
三、气体环境和氢离子溶度
95 % 空气+5 % CO2 四、生存所需基本物质
pH值为7.2~7.4
（一）糖；（二）氨基酸； （三）促生长因 子；（四）其它物质
五、渗透压：260 ~320 mOsm/kg （等渗）
和庆大霉素
第四章 清洗与消毒
一、玻璃器皿的清洗 （一）浸泡 （二）刷洗 （三）浸酸 : 24h
12
不同的强度清洗液
类 型 重铬酸钾 （g ）
强 液 63 次强液 120 弱 液 100
浓硫酸 （ml） 1000 200 100
蒸馏水 （ml）
200 1000 100
（四）冲洗
13
二、胶塞的清洗
三、塑料器皿的清洗
10
（二）培养液的种类
生长培养液 维持液
基本培养基 80~90 % 95 %
血清 10~20 %
2~5 %
第四节 其它溶液
一、消化液 ：胰蛋白酶溶液 0.25%或 0.125%； 0.02% EDTA（Versene）溶液
11
二、pH调整液 1.NaCO3液：7.4%、5.6%、3.7% 2.HEPES（分子量238.31）液 三、抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素
4. 病毒污染：
27
参考文献
1．薛庆善 主编.体外培养的原理与 技术.北京：科学出版社，2001.2
2．鄂征. 主编.组织培养和分子细胞 学技术. 北京：北京出版社， 1994.12
3．司徒镇强.细胞培养.西安：世界 图书出版社公司西安分公司.1996.
体外扩增培养的nkinkt细胞及...
前言NK细胞（natural killer），即自然杀伤细胞,是机体固有免疫的组成细胞。
NK细胞主要来源于骨髓，在骨髓微环境中逐渐发育成熟，分布至外周血中。
当病毒感染细胞、寄生虫侵入等感染因素发生及自身细胞衰老、恶变时，NK细胞可以识别这些异常的细胞，通过穿孔素/颗粒酶途径直接裂解异常细胞，或者通过Fas-FasL、激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)途径达到杀伤靶细胞的目的。
iNKT细胞，即恒定自然杀伤T细胞（invariant natural killer T cell）,是体内NKT细胞的一类亚群，具有CD1d限制性。
胸腺中的CD4+CD8+双阳性的前体细胞发育为成熟的iNKT细胞后进入外周淋巴组织，主要通过分泌不同的细胞因子调节机体Th1/Th2类免疫应答的平衡，也可以通过与树突状细胞的相互作用增强NK细胞和细胞毒性T细胞的作用，以杀伤肿瘤。
γδT细胞起源于骨髓来源的CD4-CD8-双阴性前体细胞，在胸腺中经历阴性选择故获得自身免疫耐受性，不经历阳性选择故获得非MHC限制性，识别抗原谱广，类似于NK细胞，γδT细胞不仅可以直接通过穿孔素/颗粒酶途径直接杀伤靶细胞，还可以通过Fas-FasL 途径诱导靶细胞凋亡，并且可以分泌细胞因子和趋化因子，调节体液免疫和细胞免疫。
γδT细胞甚至可以作为专职的抗原提呈细胞发挥抗原呈递作用。
以上3种细胞均为人体免疫系统的重要组分，在机体抗感染、抗肿瘤等免疫反应中拥有巨大潜能，近年来相关研究热度较高，主要集中在如何提高细胞扩增效率，以及扩增后的效应细胞是否能够保持甚至提高杀伤肿瘤和抗感染的能力。
本课题中，我们采集健康供者的静脉血，分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），在体外活化并大量扩增NK细胞、iNKT细胞和γδT细胞，通过对比扩增培养前后的细胞数量，及扩增培养后得到的免疫细胞的表面分子表达情况、细胞因子分泌情况、对肿瘤细胞的杀伤活性，进一步探索以上细胞体外扩增的效率及以上细胞应用于肿瘤治疗的可行性，这将为恶性肿瘤的过继性细胞免疫治疗的临床应用提供有力的实验室依据。
动物细胞培养及传代
一些特殊的促细胞附着的物质可能参加细胞的贴附过程。 （存在于细胞膜表面或培养液尤其血清中的蛋白质）
贴附过程：带阳电荷的促贴附因子先吸附于介质上，悬
浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的介质附着，以后 细胞将伸展成其原来的形态．
运动的接触抑制及生长的密度抑制 接触抑制:
当两个正常的细胞移动而互相靠近时，其中之一或两 个将停止移动并向另一个方向离开，使细胞不会重叠。 当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时, 细胞不再移动,此即接触抑制。 正常细胞不互相重叠于其上面生长,但肿瘤细胞可重叠 生长。
5、还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸 利用。
DMEM培养基配方(1L)
DMEM粉末 碳酸氢钠 谷氨酰胺 丙酮酸钠 青霉素 链霉素 HEPES
13.48g 3.7g 0.584g 0.11g 105U/L 105U/L 5.96g
核移植 细胞融合 细胞培养
胚胎移植
动物细胞培养技术之成就与贡献
生物制品
细胞生理\ 药理\病理 研究
有毒物质
检测
• 病毒疫苗 • 干扰素 •单克隆抗 体
•筛选抗癌 药物
动物细胞培养
动物细胞培养
教学目标
理解动物细胞的特点； 掌握动物细胞培养的定义； 理解动物细胞的体外培养生长特性； 掌握动物细胞培养过程、条件及 了解动物细胞的特点掌握动物细胞培养 的定义 基本技术。
（7）促生长因子等物质
通常情况下,血清可以提供这些生长因子.
血清 常用的血清是小牛血清CS、胎牛血清FBS、 马血清HS和人血清HS。最常用的是小牛血清, 胎牛血清次之。 血清是极其复杂的混合物
组织培养技术
1、潜伏期(Latent
Phase)
主要过程：
1）粘附与贴壁（锚着依赖性细胞）
细胞附着于底物上，游离期结束; 细胞株平均在10分钟~4小时贴壁 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 带正电荷的糖蛋白促贴壁因子先吸附于底物上， 悬浮细胞再与有促贴壁因子处附着。
2）铺展 3）细胞运动 4）细胞分裂
贴壁、铺展、细胞运动、细胞分裂
(三) 细胞功能态(Functional )
细胞周期的分子调控
G1-S-G2-M
Cyclin CCK
周期素复合体
（四） 细胞增殖类型
1、 干细胞（最易培养） 2、 活跃增殖细胞 3、 功能Ⅰ型细胞 4、 功能Ⅱ型细胞
（五）干细胞
1、基本属性 2、分类 全能性 (TPS) 多能性 (PPS) 单能性 (MPS) 3、一般性状
细胞增殖周期
G1 phase: 合成DNA复制所需蛋白(RNA) . S phase: 合成DNA和组蛋白
G2 phase: 合成少量RNA M phase: 有丝分裂, 形成两个子代细胞
1．G1 期 DNA合成前期或细胞分裂后期 2．S 期 DNA合成期 3．G2 期 DNA合成后期或细胞分裂前期 4．M 期 细胞有丝分裂期 1）前期 2）中期 3）后期 4）末期 （体内 受精卵特殊分裂增殖 — 连续增殖） --异常分裂
八、不同性别生物性状类型（名词解释） 二倍体细胞 永生性细胞 肿瘤细胞 遗传缺陷细胞
九、 能量代谢 (一) 糖代谢 (二) 蛋白质代谢 (三)脂类代谢 (四)核酸代谢
十、 细胞附着底物
(一) 玻璃 (二) 一次性塑料 聚苯乙烯、聚四氟乙烯 (三) 微载体
第三节
培养细胞 成功率的分析
细胞体外培养里面加人血清白蛋白的意思
细胞体外培养里面加人血清白蛋白的意思细胞体外培养是一种在实验室中培养和繁殖细胞的技术。
在这个过程中，培养基中通常会添加一定比例的人血清，以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
而在一些特定的实验条件下，为了满足细胞对特定蛋白质的需求，人血清白蛋白会被添加到培养基中。
1. 细胞体外培养的基本概念细胞体外培养是一种用于研究细胞生长和生物学特性的重要技术。
通过培养细胞体外，研究人员可以更方便地对细胞进行操作和观察，从而揭示细胞的生理、代谢和分化等方面的特性，并为医学研究和药物开发提供重要的实验数据。
2. 人血清在细胞培养中的作用人血清作为一种含有多种生长因子、蛋白质和营养物质的营养液，在细胞培养中起着至关重要的作用。
它可以为细胞提供所需的营养物质，促进细胞的生长和繁殖。
另外，人血清中还含有一定比例的生长因子和激素，可以调节细胞的代谢和生长，对细胞的分化和功能发挥起着重要作用。
3. 人血清白蛋白的添加意义人血清白蛋白是一种重要的蛋白质成分，其在细胞培养中的添加不仅可以提供额外的营养物质，更重要的是可以模拟细胞在体内的生长环境，促进细胞的正常生长和功能发挥。
在一些特定的实验条件下，例如神经细胞的培养、癌细胞的研究等，人血清白蛋白的添加可以更好地满足细胞对特定蛋白质的需求，促进细胞的正常生长和功能发挥。
4. 添加人血清白蛋白的培养基配方和使用注意事项在进行细胞培养实验时，如果需要添加人血清白蛋白，一般可以根据实验的具体要求在培养基中添加适当比例的人血清白蛋白，例如0.5、1等。
在添加人血清白蛋白时，需要严格控制培养基的成分和比例，以确保细胞在最适宜的生长环境中。
另外，在培养过程中要注意对人血清白蛋白的保存和使用，避免因保存不当或者污染导致细胞培养失败。
总结：细胞体外培养是一种重要的实验技术，而人血清白蛋白的添加则可以进一步优化培养环境，满足细胞对特定蛋白质的需求，促进细胞的正常生长和功能发挥。
在进行细胞培养实验时，研究人员需要根据实验的具体要求合理添加人血清白蛋白，并严格控制其成分和比例，以获得准确可靠的实验结果。
细胞培养复习题含答案)
1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型：粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。
）⑵可分四型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞 (3)游走型细胞 (4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。
此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。
处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。
细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。
②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。
一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。
③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。
以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。
⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。
此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。
底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。
细胞株潜伏期一般为6～24小时。
④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。
细胞培养基本技术
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
体外细胞培养的基本方法和技术
能够进行克隆培养的细胞一般只是一些活 力强、增殖能力强、对体外生长环境适应 性强的细胞。
八、微载体细胞培养法
微载体细胞培养法是一种是用于培养贴壁 依赖性细胞的大规模培养技术。
这种培养技术是在培养容器内加入培养液 及一种用对细胞无害的材料制成的颗粒 （微载体），使细胞在微载体表面覆着和 生长，通过不断的搅拌使微载体保持悬浮 状态的培养方法。
培养液中大量的微载体为细胞提供了极大 的生长表面，从而在培养容器体积不很大 的情况下，可培养大量的细胞。
第二节 原代培养
原代培养：从直接取自生物体细胞、组织 或器官开始的培养。 原代培养也叫初代培养，是从供体取得细 胞后在体外进行的第一次培养。 原代培养是建立各种细胞系的第一步，是 从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最 基增殖而产生一个子细胞群的过程。
克隆培养法也可以称作为单细胞分离培养法， 就是从细胞悬浮液中获得的单个细胞用于培 养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的方法。
克隆培养不同于普通的原代培养或传代培 养，他强调培养产物的单一性而排除异质 性，所获得的培养产物为遗传特性几乎完 全相同的纯细胞系即细胞株。
所谓旋转管培养法，就是将所培养的组织 细胞接种在一管状培养器皿，再将旋转管 固定在一个可旋转的装置上边旋转边培养 的一种培养方法。
旋转管培养法的最大优点，随着旋转管的 转动，所培养的组织细胞浆交替接触到培 养液和气体环境。有利于培养物的生长。
五、培养板培养法
培养板培养法过去曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培 养方法之一。
二倍体细胞培养法并不是一种专门的培养技术
用于生产的动物细胞系种类
用于生产的动物细胞系种类1. 哺乳动物细胞系：哺乳动物细胞系是最常用的动物细胞系之一，包括人类细胞系和其他动物细胞系，如小鼠、大鼠、豚鼠、猴子等。
这些细胞系可以在体外培养中生长和繁殖，并广泛用于研究、药物开发和生物技术应用等领域。
2. 鸟类细胞系：鸟类细胞系是一类用于生产和研究的动物细胞系，包括鸡、鸭、鹅等鸟类细胞系。
这些细胞系在病毒研究、疫苗生产和基因表达等领域中起着重要作用。
3. 鱼类细胞系：鱼类细胞系是一类用于研究和生产的动物细胞系，包括斑马鱼、金鱼等。
这些细胞系在鱼类生物学研究、环境毒理学和水产养殖等领域中具有广泛的应用价值。
4. 昆虫细胞系：昆虫细胞系是一类用于研究和生产的动物细胞系，包括果蝇、蚊子等昆虫细胞系。
这些细胞系在基因工程、昆虫生物学研究、农药筛选和昆虫媒介疾病控制等领域中起着重要作用。
5. 爬行动物细胞系：爬行动物细胞系是一类用于研究和生产的动物细胞系，包括蜥蜴、蛇等爬行动物细胞系。
这些细胞系在爬行动物生理学、毒理学和生态学研究等领域中具有重要意义。
6. 线虫细胞系：线虫细胞系是一类用于研究和生产的动物细胞系，主要是指秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）细胞系。
这些细胞系在发育生物学、神经科学研究和药物筛选等领域中广泛应用。
7. 哺乳动物胚胎干细胞：哺乳动物胚胎干细胞是从早期胚胎中分离并培养的一类多能干细胞。
它们具有高度的分化潜能，可以分化成多种细胞类型，并广泛用于再生医学、组织工程和疾病模型构建等领域。
请注意，以上列举的是一些常见的动物细胞系种类，并不代表全部。
随着科学技术的进步和研究的深入，可能还会不断涌现新的动物细胞系种类。
体外培养细胞的生长与增殖过程(一)
体外培养细胞的生长与增殖过程(一)体外培养细胞是现代细胞学研究的重要基础，也是医学研究的重要手段之一。
体外培养细胞的生长和增殖是一个复杂的过程，需要精细的培养条件和细致的管理。
本文将从以下几个方面介绍体外培养细胞的生长和增殖过程。
一、细胞的接种和传代体外培养细胞的生长和增殖需要一个适当的组织培养基和细胞接种。
传统的组织培养基是红细胞凝集素（RPMI-1640）或培养基199等，它们含有适量的营养成分和生长因子，可以促进细胞生长。
细胞接种需要一定的密度，通常为1×105~1×106个/ml。
传代是细胞培养过程中必不可少的一个环节。
当细胞达到一定密度时，需要将细胞分离到新的培养瓶中，以避免细胞过于拥挤而妨碍生长。
二、生长曲线体外培养细胞的生长呈S型曲线，包括四个阶段：潜伏期、对数期、瓶颈期和平台期。
潜伏期是指细胞在初始接种后的一段时间内，细胞数量没有明显变化。
对数期是指细胞增殖达到指数增长阶段，此时细胞最为活跃，速度也是最快的。
瓶颈期是指细胞数量增长缓慢并维持在一个相对稳定的水平，此时通常需要进行传代。
平台期是指细胞数量不再增加，生长停滞。
三、增殖与分化细胞的增殖是指细胞数目不断增加的过程，是体外培养细胞生长的一个重要指标。
细胞分化是指在体外条件下，细胞具有表型（形态、功能）上的变化和特化，并且达到一定稳定状态的过程。
体外培养细胞的增殖与分化是相辅相成的过程。
四、影响细胞生长的因素细胞培养过程中，细胞生长受到多种因素的影响。
其中最重要的因素是培养基成分，包括营养成分、生长因子、基质和血清等。
其次是pH 值、温度、湿度、氧气浓度和细胞密度等因素。
此外，能够滋养细胞，维护生长的关键还在于培养容器、培养条件以及细胞管理等诸多因素。
五、细胞应用体外培养细胞不仅是理解生命本质和人类疾病的基础，还能够应用于多种领域。
例如，细胞培养可用于生产生物制品，如疫苗和药物。
此外，它还可以用于细胞和分子生物学研究，包括基因工程、细胞分离和筛选技术等。
细胞培养技术_第二讲
密度抑制（density inhibition）：培养液 中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养 的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细 胞分裂停止。
传代细胞可连续传7~10代，细胞形状基本相同， 但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现 为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒 样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去 贴壁能力，从培养瓶底脱落。
组织培养细胞生命期
原代培养期 传代期 衰退期
原代培养期
又称初代培养期 （primary culture），从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1～4周。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。
细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存 性强。
传代培养期
一般经数小时-几天
过程:
游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相
初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性 细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种 因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤 维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein： CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细 胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从 各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞 生长增殖条件之一。
神经元和其它细胞的体外培养
神经元和其它细胞的体外培养神经元和其他细胞体外培养是神经生物学领域的研究重点。
这种技术可以用来研究神经元对不同刺激和药物的反应、神经元增殖和形态学变化等方面。
此外，这种技术还可以用来制备大量的细胞，以用于药物筛选和基因工程等领域。
下面我们就来详细了解一下神经元和其他细胞的体外培养技术。
1. 基本概念细胞体外培养是指将细胞从动物或植物体内取出并在体外特定的培养基中进行生长和维持细胞生存的过程。
在神经生物学中，神经元或其他神经细胞可以分离和培养。
神经元是一种非常重要的细胞类型，它是神经系统的基本功能单元。
神经元由细胞体、树突、轴突和突触四部分组成。
树突和轴突是神经元和其他神经细胞之间的联系。
为了保证神经元在体外培养的成功，必须在细胞培养前认真准备培养基和其他必要的试剂。
2. 培养基的制备培养基是细胞体外培养不可缺少的组成部分，一般由水、糖、氨基酸、维生素和生长因子等组成。
最基本的培养基是DMEM（Dulbecco最小必需培养基），它能够支持多种细胞的生长和分化。
以人体为例，对于神经元和其他神经细胞体外培养，需要添加生长因子，如NGF（神经生长因子）等。
NGF是神经元的生长因子，能够刺激神经元的生长和增殖。
此外，还需添加血清、氧化物和胶原酶等试剂来促进细胞的生长和形态学变化。
3. 细胞体外培养的方法（1）单细胞悬浮培养法：将细胞收集后直接悬浮在培养基中培养。
（2）均质化培养法：将细胞分散在表面涂有蛋白质的培养皿上，以使细胞附着在表面上并生长和扩散。
（3）移植培养法：将细胞悬浮在小孔的凝胶或其他类似的基质中，以便细胞在凝胶中生长并产生分支。
4. 细胞培养的重要性体外培养技术的发展在神经生物学科研领域中起到了重要的作用，对神经元的大规模培养和成像、神经萎缩和神经细胞增殖等方面进行了深入的研究。
此外，它还可以用于基因工程和药物筛选，为向神经系统提供较好的药物和治疗方案提供了有力的支持。
细胞体外培养技术可通过培养基和培养方法的选择等多种方式来不断完善。
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
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体外培养细胞的种类和命名体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。
最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。
我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。
（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。
一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。
（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。
无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。
这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。
为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。
而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。
当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。
（三）克隆细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）（四）二倍体细胞细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。
如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。
二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。
但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。
人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。
由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。
为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。
（五）遗传缺陷细胞从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。
这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。
（六）肿瘤细胞系或株这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。
肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。
对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。
但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今别举以下几种代表性的细胞名称供参考：HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。
二、建立细胞系（或株）的要求关于什么样的体外培养细胞群，可被确认为是已被鉴定的细胞（Certified Cells），国际上也尚无统一的规定，一般依具体情况而定。
在只用作初代培养细胞，只要供体性别、年龄等均一，取材部位及组织种类等条件稳定，做鉴定的项目无需很多，有几项能说明细胞的相关性状的即可。
如能长期保存并可供其它研究室使用，特别是做反复传代的细胞，习惯上有以下一些要求，并在刊物上报道时应加以说明。
（－）组织来源应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。
（二）细胞生物学检测应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等实验。
（三）培养条件和方法各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。
三、已建立细胞系或株的鉴定、管理和使用近些年，当一个细胞系或细胞林建成后，我国常通过组织专家开鉴定会的形式予以鉴定，从学术角度考虑，此举实非必要。
按国际惯例，只要研究认真负责地把有关资料在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。
以前因未建立统一的细胞库时，对已建立的细胞系（株）多由作者单位自行保管，有浪费人力、交流使用不便、细胞易污染和丢失等弊病。
我国已初建成小规模贮存细胞机构，待获进一步发展，这对我国细胞培养必将有更大促进作用。
国际上美、英和日本等国已建有细胞库；美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中ATCC 不仅是美国也世界最大的细胞库。
ATCC下属有一组协作实验室和一个由众多专家组成的咨询委员会。
ATCC也是美国国立癌症研究所（NCI）和美国卫生研究所中（NIH）的资源库，尤与NCI有密切的关系。
ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。
ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系（1992），其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系；和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。
ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费。
）ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准，ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等冻存液：培养基和防冻液名称细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测免疫检测：一两种血清学检测细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名以上为ATCC入库基本要求，杂交瘤入库标准尚有所不同，详细情况请参阅ATCC 的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”十二、细胞培养方式1.静止培养应用细胞管，多孔板，空斑瓶，罗氏瓶等。
培养时静止不动。
注意以下几点：（1）培养量一般不要超过总体积的1/3，液体厚度不要超过1cm，这样就可以有足够的空间以保证细胞培养中对氧的需要。
（2）若用普通孵箱培养，必须盖紧盖子或塞紧橡皮塞，或贴紧胶纸，以防培基碱化，如用CO2孵箱培养则不要盖紧瓶盖，并将CO2浓度控制在5％、（3）一般2d换一次液，细胞长成单层要及时分种传代。
（4）用过的培养瓶可再次使用，但不要超过3次，一般来说，静止培养的细胞质量较好，产量也高，故有人将其扩大成多层盘，用以大量生产HuIFN－β。
2.旋转培养应用转瓶并放置在转床上培养。
该法较静止培养更能多地利用培养面积，并使细胞更好地进行气体交换。
它是经典的用以生产生物制品的培养方式，目前仍被广泛采用。
为了进一步增加面积，有人在转瓶内加入多层同心圈。
3.悬浮培养它适于一切能在悬浮条件下生长增殖的细胞，即非贴附依赖性细胞。
用于该类细胞培养的设备结构基本与培养细菌的相同，一般将用于细菌培养的称为发酵罐，用于细胞培养的称为生物发应器。
一般小于5L的可采用玻璃罐，玻璃要求用低碱的硼硅酸盐玻璃，大于5L的改用不锈钢或肽钢。
4.微载体培养它适于一切贴附依赖性细胞，即贴壁细胞的培养，这类细胞与悬浮细胞不同，必须贴附于物体表面才能生长。
为了增加单位培养容积内的表面积，1967年荷兰的van Wezel创造了用葡聚糖制成微球，即微载体培养贴壁细胞的新技术，到80年代已被正式用于HuIFN－β的工业化生产。
理想的微载体需具备如下一些条件：表面性质适于细胞的附着、伸展和增殖。
微载体的比重在1.030～1.045g/ml，使载体在低速搅拌时就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于换液和收获。
大小以直径在100～230μm为好，并要尽可能地均一，这样有利于细胞均匀地分布于各微载体表面。
透明，适于在倒置显微镜下观察细胞在载体上的生长情况。
无毒性、不仅要求对细胞的生长无毒性，而且也不会产生有害因子于培养基内。
基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载体相互摩擦损伤细胞。
5.微载体培养的传代和扩大培养6.微载体的再生回用为了降低载体的消耗，有些类型的微载体还可以再生利用。
7.巨载体和微囊培养它与微载体培养不同，细胞不是贴附在载体表面而是包埋在凝胶载体或微囊内，因此它们被统称为包埋法。
由于有的凝胶载体制备得较大，直径2～3mm，因此又称为巨载体培养。
8.多孔微球培养它把微载体和巨载体两者优点结合在一起，细胞既可附着在载体表面，又可以渗入载体较大的孔隙而生长在载体内。
1985年Verax公司介绍了它们的产品IMMO微球，并成功地用以生产单克隆抗体。
9.中空纤维培养该培养器模拟机体的毛细血管系统，由数百乃至数千根中空纤维集束组成。
该纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚50～75μm，成多孔性。
内层为超滤膜，可用以截留不同分子量的物质，内径200μm，两端用环氧树脂等材料将纤维粘合在一起，并使内腔开口于外加塑料圆筒内，使形成两个隔开的腔。
内腔用以灌流充以氧气的培基，外腔用以培养细胞。
（如图所示）细胞可附着于纤维表面，也可渗入海绵状纤维壁，1至3周后细胞可占据所有纤维内空间，并在纤维表面堆积成多层，细胞密度可达 106～107/cm2。
此时细胞的分裂处于停顿，但其它代谢和分化功能可保持数日之久。
10.灌流培养有人称它为过滤培养法，它的特点是在培养过程中，不断地灌流补充新鲜培基，同时不断地排走已消耗的培基以及细胞在代谢过程中产生的有害物质，这样就可大大提高细胞的培养密度，也就提高了细胞产物的产量。