基因表达载体构建
基因治疗中的表达载体构建与优化方法
基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
基因过表达载体构建方法
基因过表达载体构建方法
基因过表达载体构建听起来很复杂，但其实就像是搭积木一样，有一些基本的“零件”和步骤哦。
咱得先有个载体，这个载体就像是一辆小货车，可以把我们想要过表达的基因运到细胞这个“目的地”。
常见的载体有质粒载体呢。
这质粒载体就像是那种多功能小货车，有很多不同的类型，像pCDNA系列的就很常用。
然后就是要把我们感兴趣的基因弄到手啦。
这基因从哪来呢？可以从细胞里提取出来，就像是从一个装满宝贝的盒子里把我们想要的那个小宝贝（基因）挑出来。
不过现在更多的是直接根据基因的序列合成它，就像按照设计图定制一个小零件一样。
拿到基因后，就要把这个基因连接到载体上啦。
这就需要一些特殊的“胶水”，也就是酶啦。
像限制性内切酶，它就像一把小剪刀，能在载体和基因上剪出特定的切口，这样就能让基因和载体像拼图一样严丝合缝地拼接在一起。
还有DNA连接酶，它就是把拼好的地方紧紧粘住的“胶水”，确保基因稳稳地待在载体上。
构建好之后呢，可不能就这么直接用啦。
得先检查检查，看看这个基因是不是真的好好地在载体上了。
这时候就可以用一些检测方法，比如酶切鉴定。
就像检查小货车上的货物有没有绑紧一样，如果酶切出来的片段大小和我们预期的一样，那说明构建成功的可能性就很大啦。
基因过表达载体构建虽然有点小复杂，但只要按照这些步骤一步一步来，就像搭小积木一样，总能把这个小工程完成的，而且这在基因研究里可是超级重要的一环呢。
基因表达载体构建的具体操作流程
基因表达载体构建的具体操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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基因表达载体的构建 教学设计
《基因表达载体的构建》教学设计
一、教学目标
阐明基因表达载体的组成和构建过程
二、教学重难点
基因表达载体的构建过程
三、教学过程
1.基因表达载体的构建目的
基因工程的核心是基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
同时使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
一个基因表达载体的组成，除了有目的基因外，还必须有启
动子、终止子、标记基因等。
①启动子：启动子是一段有特殊序列结构的DNA片
段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶
识别和结合的部位，有了它才能够驱动基因转录出mRNA，最终表
达出人类所需的蛋白质。
②终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊
序列结构的DNA片段，是转录过程终止的信号。
③标记基因的作用：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为标记基因。
3.基因表达载体的构建程序
单酶切：先用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶（同尾酶）切割载体和含有目的基因的片段，再用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上，形成重组DNA分子。
双酶切：用酶a,酶b两种酶切割质粒和目的基因。
因为酶a,酶b产生的黏性末端不同，所以可以防止质粒重新环化，酶a切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，酶b切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，所以目的基因和质粒连接的时候只能正向连接，防止了质粒和目的基因反向连接，目的基因两端的切口的黏性末端不同，所以可以防止目的基因自身环化。
另外还可以防止质粒与质粒以及目的基因与目的基因的自身大量连接,大大提高正确连接的效率。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
第三章 第一节 基因工程（基因表达载体的构建）
4．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列 操作与实验目的不符的是（ C ）
A．用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和连接酶构建重组质粒 B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞 C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞 D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
三、目的基因及其表达产物的检测鉴定
1．检测与鉴定的内容、方法
阅读教材98~99页的内容，根据表格提示的项目填写表格中缺 少的内容。
检测水平
分子水 DNA 平的检 RNA
测 蛋白质 个体水平的检测
检测内容
方法
结果显示
1．检测与鉴定的内容、方法
检测水平
检测内容
方法
结果显示
检测转基因生物的染色体 DNA分子杂交法（基因探针
3．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全 能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
4．大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但 又有所不同。大肠杆菌为原核生物，而酵母菌为真核生物（具有 多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质 时比大肠杆菌有优势。 有内质网和高尔基体
2．病毒感染法 用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞， 也能使目的基因导入动物细胞内。
（三）将目的基因导入微生物细胞 1．感受态细胞 经过适当的处理（如用Ca2+处理）后，细胞质膜对DNA的通透性会
发生改变，细胞变得容易接受外来的DNA，处于这种状态的细胞称为 感受态细胞。
2．过程
Ca2+处理微生物细胞
感受态细胞
基因表达载体的构建方法
基因表达载体的构建方法
基因表达载体是一种用来传递外源基因并在宿主细胞中表达的工具。
构建基因
表达载体是基因工程研究中的重要一环，下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的载体。
常见的基因表达载体包括质粒、病毒等。
在选择载体时，需要考虑载体的大小、稳定性、复制能力、宿主范围等因素，确保选择的载体能够满足所需的表达要求。
其次，准备外源基因。
外源基因可以通过PCR扩增、化学合成等方法获取。
在获取外源基因时，需要考虑基因的大小、序列的一致性、是否含有启动子、终止子等重要元件。
接下来，进行连接。
将外源基因与载体进行连接，通常采用限制性内切酶切割
和连接酶的作用，将外源基因与载体进行粘连连接，形成重组载体。
然后，进行转化。
将构建好的基因表达载体导入宿主细胞中，通常采用化学法、电穿孔法、病毒载体法等方法进行转化，确保外源基因能够成功地表达。
最后，筛选和鉴定。
通过抗生素筛选、酶切鉴定、测序等方法对构建好的基因
表达载体进行筛选和鉴定，确保所构建的基因表达载体能够稳定、高效地表达外源基因。
在构建基因表达载体的过程中，需要注意实验操作的严谨性和规范性，确保实
验结果的准确性和可重复性。
同时，还需要根据具体的研究需求和实验条件，选择合适的构建方法和实验方案，以确保构建的基因表达载体能够满足所需的表达要求。
总的来说，构建基因表达载体是基因工程研究中的重要一环，通过选择合适的
载体、准备外源基因、进行连接、转化、筛选和鉴定等步骤，可以构建出稳定、高效地表达外源基因的基因表达载体，为基因工程研究和应用提供重要的工具和平台。
(完整word版)基因表达载体构建
一、简述原核生物和真核生物基因表达调控的异同点，并说明基因表达调控与基因工程表达载体构建的关系。
1．原核生物和真核生物基因表达调控的共同点：（1）结构基因均有调控序列；（2）表达过程都具有复杂性，表现为多环节。
2．不同点：原核生物：（1）RNA聚合酶只有一种，其σ因子决定RNA聚合酶识别特异性；（2）操纵子模型的普遍性；（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；（4）转录和翻译偶联进行；（5）转录后修饰、加工过程简单；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
真核基因表达调控特点：（1）RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；（2）活性染色质结构发生变化；（3）正性调节占主导；（4）转录和翻译分隔进行；（5）转录后修饰、加工过程较复杂；（6）转录起始是基因表达调控的关键环节。
3.由于基因的表达调控受到多种因子的影响，而构建基因工程表达载体时多是将真和生物的目的基因转入到原核生物载体上表达，所以应注意以下几点：（1）外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。
其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码。
否则会导致编码错误的蛋白质分子，特别是目的基因序列内部应不含两端酶切位点的识别序列。
（2）插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA 聚合酶能够识别插入的基因。
（3）外源基因必须能在大肠杆菌中进行有效转录（如无内含子），转录后的mRNA 在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。
二、目的基因功能和表达分析的意义是什么？目的基因功能与表达分析的主要环节有哪些？各有什么目的？这些环节与基因工程的主要环节有什么异同？1．意义：克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能及基因表达调控的机理，明了其利用价值和途径。
2．主要环节：（1）目的基因的获得和加工：将得到的目的基因通过加工以期能连接到表达载体上并稳定表达；（2）载体的选择与加工：根据不同的实验目的和实验条件选择不同的载体，并对载体进行改造加工，使其满足高效连接的需要；（3）载体与目的基因的连接：即通过连接反应，将载体和目的基因连接形成重组DNA；（4）重组子导入受体细胞：通常将重组DNA导入大肠杆菌感受态进行扩增和筛选，以期得到大量的单一重组子，便于利用；（5）阳性克隆的筛选与鉴定：在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体自连、目的基因自连以及为发生连接的载体和目的基因，在转化过程中上述各种分子都会进入宿主细胞，所以需通过筛选鉴定出阳性克隆。
构建基因表达载体需要的酶
构建基因表达载体需要的酶
构建基因表达载体需要的酶主要包括以下几种：
限制性内切酶：限制性内切酶能够识别和切割特定的DNA序列，从而将目标基因和表达载体进行定向连接。
DNA聚合酶：DNA聚合酶能够将DNA单链引物与模板DNA 配对，合成新的DNA双链链，用于扩增目标基因。
磷酸酯酶：磷酸酯酶能够将DNA双链断裂为单链，用于目标基因和表达载体的连接。
磷酸二酯酶：磷酸二酯酶能够将DNA双链断裂为单链，并在链的末端加上磷酸基团，用于目标基因和表达载体的连接。
核酸酶：核酸酶能够降解RNA和DNA，用于去除不需要的RNA 和DNA杂质。
外切酶：外切酶能够切割DNA双链，用于提取和纯化目标DNA。
DNA连接酶：DNA连接酶能够将两条DNA单链连接成一条DNA双链，用于目标基因和表达载体的连接。
这些酶是构建基因表达载体所必需的重要工具，能够帮助研究人员将目标基因插入到表达载体中，并在细胞内进行高效的表达。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
基因表达载体的构建
得重组DNA能够进入细胞.
四、目的基因的检测与鉴定
分子 水平
检测转基因生物的DNA是否插入目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质
个体水平 检测性状
1、检测目的基因
DNA分子杂交技术 提取转基因生物的DNA 制作分子探针目的基因的一段单链序列 进行分子杂交
二、基因表达载体的构建核心步骤
先用同一种限制
酶分别切割目的 基因和质粒,再用 DNA连接酶将二 者连接,形成重组 DNA分子.
三、将目的基因导入受体细胞转化
常用的受体细胞：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物
细胞等.
1、受体细胞是植物细胞
农杆菌转化法：主要侵染双子叶植物伤口
分泌酚类化合物吸引农杆菌
2、检测mRNA
分子杂交技术
4、检测性状
基因枪法 花粉管通道法
1土壤农杆菌法
2基因枪法
3花粉管通道法
2、受体细胞是动物细胞
显微注射法 注入动物受精卵
1982年,世界上第一例体型比普通小 鼠大1.8倍的转基因超级小鼠诞生
3、受体细胞是微生物
将目的基因导入原核生物的好处是什么 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 要想使重组DNA顺利进入细菌细胞内,最大
基因表达载体的构建流程
基因表达载体的构建流程基因表达载体的构建呀，那可真是个超有趣的事儿呢。
咱先来说说啥是基因表达载体。
简单来讲呢，它就像是一个小快递车，专门负责把咱们感兴趣的基因运到细胞这个大“城市”里的指定地方，然后让这个基因在那儿发挥作用。
这个小快递车得有一些特殊的构造，这样才能把基因稳稳地送到，还能让基因在目的地好好工作。
那构建这个基因表达载体的流程到底是咋样的呢？一是要有目的基因。
这目的基因就像是快递车上要送的宝贝。
我们得想办法从生物的基因组里把这个我们想要的基因找出来。
这就好比在一个超级大的仓库里找一个特定的小物件，有时候可不容易呢。
可能要用到一些特殊的方法，像从DNA里把这个基因切出来。
这就像用一把超级精准的小剪刀，只把我们要的那部分基因剪下来，可不能剪错了哦。
接着就是选择合适的载体。
载体的种类还不少呢，就像快递车有不同的型号。
有的载体适合在细菌里跑运输，有的呢就适合在植物细胞或者动物细胞里工作。
我们得根据自己的需求，挑选那种和目的基因最配的载体。
这个载体得有一些特殊的地方，比如说有一些特定的位点，就像快递车上有专门放东西的小格子，这样目的基因才能安安稳稳地待在上面。
然后就是把目的基因和载体连接起来。
这就像是把宝贝小心翼翼地放到快递车上的小格子里。
这得用到一些特殊的“胶水”，在基因这个世界里，这些“胶水”就是一些酶啦。
这些酶能够把目的基因和载体紧紧地粘在一起，让它们成为一个整体。
这个过程可不能马虎，如果没粘好，在运输的过程中基因可能就掉出来了，那可就糟糕了。
再之后呢，就是要把这个构建好的基因表达载体导入到细胞里面。
这就像是把装满宝贝的快递车送到目的地城市里。
导入的方法也有很多种，不同的细胞可能适合不同的导入方式。
比如说，对于细菌细胞，可能有一种简单的方法，就像把快递车直接开到城门那里就可以进去了。
但是对于一些比较复杂的细胞，像动物细胞，可能就需要一些更复杂的手段，就像要偷偷地找个小道才能把快递车开进去。
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。
基因表达载体构建优秀课件
（一 ）基因表达载体的构建
1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？
确保目的基因在受体细胞中稳定存在、 复制、遗传和表达，使其发挥作用。
2 请你定义：基因表达载体构建之含义？
将目的基因、启动子和终止子科学按装 在经修饰和改造完备的载体之上。
3 基因表达载体之基本组成是什么？
（1）结构基因——即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。
农杆菌
农杆菌转化法示意图
农杆菌
T—DNA Ti质粒
EcoRI酶
核—DNA 目 标
目标细胞
DNA 重组
侵染 转化 转基因植物
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。
2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
2 目的基因导入受体细胞遵循的基本原理是什么？ 通常借鉴细菌或病毒侵染细胞和寄生之途径。
基因表达载体构建优秀课件
4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？ 如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中， 那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？
5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因 进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你 应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗 ？
（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。
（5）将目的 基因 插入质 粒切口处，用 E•coli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功 创建一个重组DNA分子。
基因工程-基因表达载体构建(2)
（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 DNA分子杂交 方法，用 DNA与RNA杂交 方法检测目的基因是否转录，用 免疫（ 抗原抗体反应 ）法检测目的基因是否表达。另外也 让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。 可进行个体水平检测。如 4、基因拼接成功的原因 DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱 ；
（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞 受精卵 等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的 方法有 等；农杆菌转化 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 染色体DNA 法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 显微注射法 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质 CaCl2 处理，以增大细菌 细胞壁 粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的 基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制， 由于 细菌繁殖的速度非常 ，在很短的时间内就能够获 快 得大量的目的基因。
途径 方法
供体细胞中的DNA 中直接分离基因 鸟枪法
供体细胞中的DNA ↓限制酶 许多DNA片段 ↓载入 运载体 ↓导入 受体细胞 ↓ 外源DNA扩增, 产生特定性状 ↓分离 目的基因
人工合成基因（真核细胞） 反转录法
目的基因mRNA ↓反转录 单链DNA ↓合成 双链DNA(即目的基因)
根据已知氨基酸 序列合成DNA
氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则
转基因表达成功的原因是生物 共用一套遗传密码 。 基因工程的意义： 。 目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。
实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺 中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？
基因表达载体的构建
02
转化后，目的基因需要在宿主 细胞中复制和表达，这一过程 需要适当的诱导剂和调控元件 。
03
表达产物可以是目的基因的蛋 白质产物，也可以是RNA产物 ，具体取决于目的基因的性质 和实验需求。
表达产物的检测
01 表达产物的检测可以通过免疫学方法、生物化学 方法、分子生物学方法等多种手段进行。
02 检测的目的包括确定目的基因是否成功表达、表 达产物的性质和含量等。
基因表达载体的构建
• 基因表达载体概述 • 基因表达载体构建流程 • 克隆基因的表达 • 基因表达载体的应用与展望
01
基因表达载体概述
基因表达载体的定义
基因表达载体是用于将目的基因导入 细胞并使其表达的载体，通常由质粒 或病毒等构成。
它能够将目的基因带到细胞内，并在 细胞内复制和扩增，从而使目的基因 在细胞内得到表达。
THANKS
感谢观看
01
宿主细胞应具备繁殖快速、容易培养、容易转染等 特性，以便于基因表达产物的生产。
02
宿主细胞应具备低免疫原性，以减少免疫反应对基 因表达产物的影响。
03
宿主细胞应具备对表达产物的加工和分泌能力，以 便于表达产物的纯化和收集。
转化与表达
01
转化是将目的基因导入宿主细 胞中的过程，常用的方法有电 穿孔法、显微注射法、脂质体 法等。
02
基因表达载体构建流程
选择克隆位点
确定目的基因的长度和结构
01
根据基因序列，选择合适的克隆位点，确保目的基因的完整性
和功能性。
考虑载体的大小和性质
02
根据实验需求，选择适合的载体，确保载体能够容纳目的基因
并具有所需的特性。
确定克隆位点的位置
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。
构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。
下面将介绍构建基因表达载体的步骤。
第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。
一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。
对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。
第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。
启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。
因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。
第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。
一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。
此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。
第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。
具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。
此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。
第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。
此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。
第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。
转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。
根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。
第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。
检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。
根据自己的实验需要选择合适的检测方法。
总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。
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思考与讨论：
1 基因载体必须具备的基本条件是什么？
2 基因工程可做载体的结构有那些？最 常 使 用 的载体是什么？ 3 请图示大肠杆菌质粒结构。
4 从苏云金芽孢杆菌细胞DNA分子中提取得到 Bt毒蛋白基因能否直接进入普通棉细胞中？ 如果把目的基因人工注射到普通棉细胞中， 那么该基因在棉细胞中会稳定存在，复制和表 达吗？ 5 假如你是一个基因工程操作者，若使目的基因
农杆菌转化法示意图
农杆菌 农杆菌
T—DNA Ti质粒
DNA 重组
侵染
EcoRI酶
转化
核—DNA 目 标 目标细胞 转基因植物
（二） 将目的基因导入动物细胞
1 基因工程培育转基因动物最常用、最有效的 方法——显微注射技术 （1）将含有目的基因的表达载体提纯； （2）从雌性动物体内取出受精卵细胞。 （3）用显微注射仪把目的基因注射到受精卵细胞； （4）把含有目的基因的受精卵移植到雌性动物子 宫或输卵管发育成具备新性状的动物。 2 实例 世界上第一例体型比普通小鼠大1.8 倍的转 基因“超级小鼠”就是用显微注射技术获得成
（4）复制原点——能够自我复制保证目的基因在受体细 胞中复制遗传和表达。
（5）遗传标记基因——检测受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
请你以质粒作载体构建基因表达载体之模式图
插入目的基因 启动子 终止子
基因表达载体 基因表达载体
复制原点 遗传标记基因
4 建构基因表达载体方法
（1）用某种限制酶如EcoRI限制酶，在基因插 入位点切割质粒，使质粒出现一个切口， 露出两个黏性末端。 （2）用同种限制酶切割目标DNA分子，截取目 的基因，使其产生与质粒相同的末端。
（3）依据目的基因表达的特点和位置，用限制 酶切割受体细胞相应的控制元件 ——启动 子和终止子。
（4）用限制酶将启动子和终止子与目的基因连 接起来，成为一个整体。 （5）将目的 基因 插入质 粒切口处，用 E•coli DNA连接酶把基因与质粒缝合起来，成功
进入棉细胞，并能在棉细胞中遗传和表达，你
应当采取什么办法？你能说出其中的理由吗 ？
（一 ）基因表达载体的构建
1 基因工程操作中，构建基因表达载体之目的 是什么？ 确保目的基因在受体细胞中稳定存在、 复制、遗传和表达，使其发挥作用。 2 请你定义：基因表达载体构建之含义？ 将目的基因、启动子和终止子科学按装 在经修饰和改造完备的载体之上。
2 目的基因导入受体细染细胞和寄生之途径。
（一）将目的基因导入植物细胞
1 农杆菌转化法 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，在 自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物，而 对大多数单子叶植物没有感染力 。 2 感染原理： 当植物体受到损伤时，伤口处细胞分泌大 量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞， 这时农杆菌中的Ti质粒上的T—DNA分子可转 移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色DNA 分子之上。
（三） 将目的基因导入微生物细胞
目的基因导入大肠杆菌最常用的转化方法是： 1 用Ca2+ 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于能 够 吸收环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称 为感受态细胞。
2 用大肠杆菌质粒与目的基因进行重组形成基 因——质粒重组DNA分子。
3 将基因——质粒重组DNA分子与感受态细胞 混合，在一定温度下，感受态细胞吸收周围重 组DNA分子，完成转化过程。
创建一个重组DNA分子。
建议模拟完成建构大肠杆菌基因表达载体 ，并写出具体步骤。
三 将目的基因导入受体细胞
基因导入受体细胞的标志是什么？
1目的基因与载体在受体细胞共同复制、遗 传和表达。或目的基因插入细胞染色体上DNA分 子之中，随同受体细胞DNA分子复制、遗传和表 达。 2 实际上外源目的基因变成了受体细胞的一部 分，这种现象叫做转化。
3 基因表达载体之基本组成是什么？
（1）结构基因——即提取的目的基因核苷酸序列，负责 编码目标蛋白质。
（2）启动子——位于编码蛋白质结构基因之首一段殊结 构的DNA片段，RNA聚合酶的识别部位和结合部位。 （3）终止子——位于编码蛋白质结构基因末端一段特殊 结构的DNA片段，具有终止基因转录过程的作用。