工业发酵菌种选育

2、发酵工业菌种的分离筛选
工业生产对菌种的要求
（1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成的目的产 物产量高、易于回收； （2）生长较快，发酵周期短； （3）培养条件易于控制； （4）抗噬菌体及杂菌污染的能力强； （5）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳 定； （6）对放大设备的适应性强； （7）菌种为非病原菌，不产生任何有害的生物物质和毒素。
问题？
1、如何控制营养成分，分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌？ 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉？ 3、分离放线菌、细菌、霉菌时，选择哪些抑制剂？ 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么？厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么？ 5、如何分离芽孢菌？
2.2.5 筛 选（生产能力的考察）
从自然界获得菌种的基本过程
采样
(P15)
预处理
富集培养
菌种分离
初筛和复筛
性能鉴定
菌种保藏
2.2.1 样品采集
总原则是：
（1） 样品来源越广，获得新菌种的可能性越大；
（2）要了解目标产物的性质和可能产目标产物的
微生物种类及其生理特征。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本相同，但通常丝 状菌及产芽孢细菌才能进行次级代谢。
②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生长环境等。
1 ） 土样选择 酵母菌 果园 产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂 高温酶产生菌 火山或温泉 耐压菌 油井或海洋深处 纤维素酶 森林
2）采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-25cm处的土约10-25g，盛入无 菌的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采 样时间、地点、环境条件等，以备查考。
（2）酶合成的阻遏
①末端产物阻遏： 常普遍存在与氨基酸、核苷酸生物合成途径中。 ②分解代谢物阻遏： 如：“葡萄糖效应”。其代谢物阻遏“缓慢利 用能源”酶的合成。例如：葡萄糖对乳糖诱导酶的阻遏作 用。

2、酶活性的调节
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生产目的：高浓度地积累人们所期望的产物。
平衡→ 打破→ 建新平衡→高浓度地积



诱变育种包括诱变和筛选两个部分。
诱变成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量 的选择。
(1)诱变剂和诱变处理

物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快 中子； 紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变 DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。
化学诱变剂： 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。
6．取中间培养液稀释分离、培养。
7．挑取菌落进行筛选。
亚硝基胍诱变曲霉菌

N—甲基—N‘-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真
核或原核微生物都有强烈的诱变作用。

其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷 的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的
DNA复制系统，从而诱发了变异。



变色圈法：如果胶酶产生菌、谷氨酸生产菌等； 透明圈法：如淀粉酶生产菌、纤维素酶生产菌等； 生长圈法：工具菌是营养缺陷型菌株。 抑菌圈法：工具菌一般是抗生素敏感菌。
拮抗菌对白绢小菌核菌的抑制 酪素培养基和淀粉培养基 拮抗菌对青枯病菌的抑制
培养条件控制

营养成分控制、控制培养基的pH、添加抑制剂、热处理、 控制培养温度、控制通气量
化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
使用化学诱变剂的优缺点： 就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 选用最适剂量，充分利用复合处理的协同效应。
Mutation
Via chemical or physical, and biological means
(2)诱变剂的选择
1）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回 复突变率高，效果不大。 2）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲 基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 3）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 4）紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的 最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响 邻近基因的性能。
2.4 发酵工业菌种改良
菌种改良目的：
1 提高产物产量
2 提高产物纯度，减少副产物
3 改良菌种性能，改善发酵过程 4 改变生物合成途径，获得高新产品
2.4.1 微生物代谢生理与分子生物学
2.4.1.1初级代谢和次级代谢
初级代谢：与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消 耗的代谢类型。 生存必需；始终产；不同种，相同；环境敏感性
2.2.2 样品的预处理
目的：提高菌种的分离效率。 （1） 物理方法： 热处理：常用来减少样品中的细菌数。 ①膜过滤和离心法：用来浓缩水中的微生 物细胞。 （2） 化学方法： ② 在培养基中添加某些化学成分来增加特定微 生物数量。 （3）诱饵法： 将一些固体物质加到待分离的土壤或水中做 成诱饵富集目的菌。
2.2.3 富集培养

富集培养：人为地增加分离概率，增加该菌种的数量，使 目的微生物在种群中占优势。 方法：控制一定的养分（碳源或氮源）；控制一定的培养 条件（温度、pH、底物等）。

2.2.4 培养分离

纯种分离的方法有平板划线分离法、稀释分离 法、涂布分离法、毛细管分离法 、小滴分离法。
常用的平板快速检测法有：
华根霉能产生酒精、芳香脂类、乳酸及
青霉菌
产黄青霉：是青霉素的最重要生产菌，并能产 生葡萄糖氧化酶及葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血 酸等。 展开青霉：主要用于生产抗真菌的抗生素－灰 黄霉素。
4）放线菌
常用的有链霉菌属、小单孢属等，如龟裂链霉菌、金霉 素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌 应用：土霉素、四环素、链霉素、红霉素。从微生物中 发现的抗生素有60%以上的是来自于放线菌。
§2
发酵工业菌种
1、工业上常用的微生物



微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、 食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工 等方面。 微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于 大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近 千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有 巨大的潜力可挖掘。 工业上常用菌种：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌
(3) 诱变育种步骤
•出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •分离和筛选 出发菌株→纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→ 过滤→菌悬液→诱变处理→平板分离→筛选→保藏/扩大试验
（活菌计数） （计数）
(4)例子 紫外线的诱变育种
紫外线诱变一般采用 15W紫外线杀菌灯 ，波长为250-
2）酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面 包酵母、毕赤氏酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白 质、生产脂肪
面包酵母
啤酒酵 母
红酵 母
3）霉菌
是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、絮 状菌丝真菌的通称。常用的有曲霉、根霉、 毛霉、青霉等.

曲霉属

黑曲霉：生产有机酸、生产淀粉 酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶
操作步骤
1）将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾去上清液，将菌体打散 加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2）将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打 散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试 管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个／ml左右，作 为待处理菌悬液。 3）取2～4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子， 然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照射前，应先开 紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射10～ 50s。操作均应在红灯下进行，或用黑纸包住，避免白炽光。 4．取未照射的制备菌液和照射菌液各o.5ml进行稀释分离，计数活菌 细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)， 120r／min振荡培养4～6h。
菌 气 丝 生
孢 子 丝
孢子
培养基
基内菌丝
5）其它
担子菌：灵芝、茯苓程菌：如酶制剂、胰岛素、干扰素、生 长激素、乙型肝炎病苗等的生产。
6）未培养微生物：利用分子生物学检测到，但还 不能获得纯培养的微生物，约占99%。 分析方法：模拟自然培养法、宏基组分析法
1)细菌（bacteria ）
发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、 乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生产酶制剂、醋酸 、乳酸、氨基酸、肌苷酸等 。用作基因工程载体的宿主 细胞.
大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量 分析，生产天冬氨 酸、苏氨酸、缬氨 酸。

乳酸杆菌 应用：乳酸、干 酪、奶子酒、发 枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶、 面、泡菜、酸奶 等的制作 蛋白酶等
2 发酵工业菌种的分离筛选
菌种分离：将混杂着各种微生物的样品按照实际需 要和菌株特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进 行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。
符合发酵工业要求的菌种可从如下途径获得： 1 从菌种保存机构直接购买所需的菌株 2 从自然界分离筛选 3 从生产过程中发酵水平高的批号中重新进行分筛
1、酶合成的调节

酶量调节：粗，慢。
（1）酶合成的诱导作用
组成酶：细胞内总是适量存在的，不依赖于酶
底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。 诱导酶：依赖于酶底物或底物结构类似物的存 在而合成的酶。
如：大肠杆菌在加入乳糖前β-半乳糖苷酶的分子数 为5个；加入后的1-2分钟内就增加到5000个。（诱 导作用，非激活作用）

初筛：平板筛选法和摇瓶发酵筛选法。 复筛：采用与生产相近的培养基和培养条件，通过