免疫组化超详细步骤

免疫组化

一实验目的：分别用 KRAS NRAS HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中 KRAS NRAS HRAS蛋白的表达情况

二实验原理 : 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素酶金属离子同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术 .

实验试剂及耗材：经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS NRAS HRAS蛋白抗体、DAB

四实验设备：切片机、4C冰箱、显微镜、烤片机

显色试剂盒抗原修复液 PBS 苏木素染料 1%盐酸酒精溶液 0.05%氨水二甲苯等

五主要试剂配置：

应用液 A NaH2PO4 38.4g 配成1000 毫升溶液

应用液 B Na2HPO4 12H2O 114.8g 配成1000 毫升溶液

配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液, 36毫升应用B液，力口8.5gNaCI 。

缓冲液

应用液A枸橼酸10.55g 配成1000 毫升溶液

枸橼酸钠抗原修复液

应用液 B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成 1000 毫升溶液

配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。

苏木素染液配方：苏木素 2g, 无水乙醇 250 毫升，硫酸铝 17.6g 蒸馏水 750 毫升，碘酸钠 0.2g ，冰醋酸 20 毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。

抗体说明书建议的抗体稀释度

N-Ras 1：50-1：500

H-Ras 1：50-1：500

K-Ras 1：20-1：200

六实验步骤：

1组织常规石蜡切片厚度 3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72C烤箱烤片2小时。

2 切片脱蜡水化程序

⑴二甲苯i、n脱蜡各 12分钟;

⑵ 无水乙醇i、n各 3分钟；（洗二甲苯）

⑶ 95%乙醇 3 分钟;

⑷ 85%乙醇 3 分钟；

3 自来水漂洗 3 分钟，洗涤一定要充分。

4 组织修复采用高温高压法：压力锅中加入pH 6.0 ， 0.01M 抗原修复液约 1000ml ，切片

插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压

力阀1300W待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。

5 停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。

6 将抗原修复后切片置自来水中，浸泡 2 分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2 ，

室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。

7取出切片，擦干组织周围液体后滴加10%BSA寸闭液，37C孵育40分钟。滴加一抗（浓度配比,PBS稀释1:20、1:50、1:100、1:200 ）60ul，注意保持组织湿润状态但表面不能有液体，用试管使抗体全部覆盖组织面且不能有气泡，以使抗体能全部与组织接触。

8滴加一抗后放入专用孵育盒内，4C冰箱过夜。

9切片放入PBS缓冲液中清洗 3分钟X 3次，充分洗涤，防止因洗涤不净引起的非特异性染色。（前两次的 PBS倒掉）

10擦干组织周围液体后滴加70微升辣根酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物（根据实际情况要求覆盖样本），37 C温箱内孵育40分钟。PBS缓冲液洗涤3分钟X 3次.

11显色，滴加现配适量DAB显色剂（在1ml试剂2 （DAB底物液）中，加入1滴（约50ul ）试剂1 （DAB 浓缩液），混合液，即配成 DAB工作液），配置 DAB显色剂的容器在冰冻切片机旁边的冰箱里，其它试剂在入门口冰箱。室温显色 ,5-20 分钟。自来水终止显色。第一遍的自来水需集中处理，自来水洗涤 3分钟。

12 复染，苏木素染液中染色 40秒，水洗 1 分钟。

13 1%盐酸酒精溶液分化 3秒，流水漂洗。

14 蓝化 10 秒，流水漂洗。

15脱水，切片依次置于 85%乙醇，95%L醇各1分钟，无水乙醇I、n中各 2分钟。

16透明，切片依次置于二甲苯I、n中各 2分钟

17 中性树胶封片。