抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
药物抑菌实验报告
一、实验目的为了探究不同种类抗生素的抑菌效果，本研究采用体外抑菌实验方法，对青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素四种抗生素进行抑菌活性测试，为临床合理用药提供依据。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等常见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
2. 实验试剂：青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素等抗生素粉末，琼脂、牛肉膏、蛋白胨、pH试纸、无菌生理盐水等。
3. 实验仪器：培养箱、恒温培养箱、电子天平、移液器、显微镜、培养皿、锥形瓶、滴管等。
三、实验方法1. 菌株活化：将保存的菌株在适宜的培养基上培养24小时，备用。
2. 制备菌悬液：用无菌生理盐水将菌株稀释至适宜浓度，备用。
3. 制备抗生素溶液：分别将青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素粉末用无菌生理盐水溶解，配制成一定浓度的抗生素溶液。
4. 制备琼脂平板：将牛肉膏、蛋白胨、琼脂和蒸馏水按比例混合，加热溶解，冷却至50℃左右，加入一定量的抗生素溶液，搅拌均匀，倒入培养皿中，待凝固。
5. 涂布菌悬液：用无菌棉签将菌悬液均匀涂布在琼脂平板表面。
6. 抑菌实验：将涂布好菌悬液的琼脂平板放入培养箱中，分别加入青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素纸片，培养24小时。
7. 观察结果：观察平板上的抑菌圈直径，记录数据。
四、实验结果1. 青霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：15mm、10mm和8mm。
2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：10mm、8mm和6mm。
3. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：12mm、9mm和7mm。
4. 氯霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌圈直径分别为：18mm、15mm和13mm。
五、实验结论1. 青霉素、氨苄西林、头孢克洛和氯霉素均具有较好的抑菌效果。
2. 氯霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑菌效果最好，其次是青霉素、头孢克洛和氨苄西林。
抗菌试验
体外抗菌试验必须严格控制试验条件，使 其尽可能标准化 。
抗菌效力的测定 药品卫生质量的检查
药物含量测定
第一节 体外抑菌试验
检查药物的抗菌效能 体内试验 体外试验 广泛应用
一、常用的体外抗菌试验（antimicrobial test in vitro）
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以 也称药敏试验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药 物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 试验大多在玻璃器皿中进行，优点是方法简便、需时短、 用药量少，不需要动物。 但是没有体内复杂的因素参与，故体内和体外抗菌试验结 果有时会不一致。
药物稀释成系列浓度
与琼脂培养基混合（1：9）铺平板 平板上接种多种试验菌（多点接种仪） 培养，观察试验菌的生长与否，判断MIC。
杀菌曲线（KCs） 不同抗菌药物的杀菌速度
（三）联合抗菌试验 检查两种或两种以上药物在联合使用时的相互作用以及抗菌药物 与不同pH或不同离子溶液的相互影响。
4．挖沟法
滤纸片法
打孔法
管碟法
挖沟法
液体~
（二）系列稀释法（serial dilution test）
固体~
微量稀释 法用微孔 稀释板代 替试管。
MIC
MBC
液体培养基稀释法
固体培养基稀释法
（1）平板法：同时测定多个试验菌的MIC （2）斜面法：适用于需长时间培养的试验菌或避免 孢子飞扬污染环境的霉菌。 平板法步骤：
细菌抑菌实验报告
一、实验目的1. 探究不同抗生素对细菌的抑菌效果。
2. 了解抗生素的抑菌机理。
3. 培养学生的实验操作能力和数据分析能力。
二、实验原理抗生素是一类能够抑制或杀死细菌、真菌等微生物的药物。
本实验通过观察不同抗生素对细菌的抑菌效果，了解抗生素的抑菌机理。
三、实验材料1. 细菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。
2. 抗生素：青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素等。
3. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、营养琼脂培养基。
4. 实验器材：培养皿、接种环、移液枪、显微镜等。
四、实验方法1. 将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养24小时。
2. 将培养好的菌液用无菌生理盐水稀释至一定浓度。
3. 在培养皿中分别加入不同浓度的青霉素、链霉素、红霉素、庆大霉素溶液。
4. 将稀释后的菌液滴加于培养皿中，使菌液均匀分布。
5. 将培养皿置于37℃培养箱中培养24小时。
6. 观察并记录不同抗生素对细菌的抑菌效果。
五、实验结果1. 青霉素对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，抑菌圈直径约为20mm；对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抑制作用较弱，抑菌圈直径分别为10mm和5mm。
2. 链霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有明显的抑制作用，抑菌圈直径分别为25mm、20mm和15mm。
3. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有抑制作用，抑菌圈直径分别为15mm、10mm和5mm。
4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌均有抑制作用，抑菌圈直径分别为30mm、25mm和20mm。
六、实验分析1. 青霉素属于β-内酰胺类抗生素，主要通过抑制细菌细胞壁的合成来发挥抑菌作用。
本实验结果表明，青霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，对其他两种细菌的抑制作用较弱。
2. 链霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要通过干扰细菌蛋白质合成来发挥抑菌作用。
本实验结果表明，链霉素对三种细菌均有明显的抑制作用，且抑菌效果最强。
第十章 药物的抗菌试验
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生物与化学工程系
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第一节 体外抑菌试验
3、E 试验（E-test）
E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基 本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从 塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓 度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明 的抑菌圈。
FIC指数的计算： FIC指数=MIC甲药联 用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙 药单用
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体内抗菌实验
最小致死量（minimum lethal dose，MLD） 或最小致死浓度（MLC）：原文为系指药 物在最低剂量组的一群实验动物中引起 个别动物死亡的剂量和浓度。
第一节 无菌制剂的无菌检查
二、无菌检查的基本方法
1、一般药品的无菌检查—直接接种法
需氧菌、厌氧菌、霉菌的检查
需氧菌：30~35℃，7天 厌氧菌：30~35℃，7天 霉 菌：20~25℃，7天 观察培养液是否混浊或涂片染色镜检
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二、活菌计数法
是在一定浓度的定量药物内加入定量的 试验菌，作用一定时间后，取样进行活 菌计数，从存活的微生物数计算出药物 对微生物的致死率。
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最新体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...-药学医学精品资料
3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1.5×108CFU/m1 的金黄色葡萄球菌菌液，在试管内壁旋转挤 去多余菌液后，在MHA 平板表面上，从不同 方向均匀涂布3次，每次旋转平板60度，最后 沿平板内缘涂抹1圈。同样方法涂布大肠埃希 菌。
4
5
平板在室温下干燥3～5min后。根据试验菌 株选择抗菌谱。如阳性球菌:金黄色葡萄球菌 选择青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA) 环丙沙 星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)等。 大肠埃希菌选用氨苄西林(AMP)、头抱唑林 (FZN)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、 亚胺配南(IMP)等。 用无菌镊子将含药纸片，紧贴于琼脂表面， 各纸片之间相距应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm，置37℃孵育18h～24h观 看结果。
原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
材料
1 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton AgarMHA） 倾注成4mm厚的12～15cm平板，将其保存 于4℃冰箱可用1周。 2硫酸钡比浊管 1.175%氯化钡 （BaCl2 .2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶 液99.5ml,充分混匀，每管4ml其浊度相当于 0.5麦氏（McFarland standard）比浊管第一 管1/2（1.5亿/ml相当于1.5×108CFU／m1）, 使用期半年。
操作方法
药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上。根据药 物性能选择溶剂。例如 取青霉素钾注射粉剂80万u/支 + 蒸馏水 4ml→20万u /ml，取1ml +9mlMH 肉汤→2万 u /ml，取2万u /ml的5.12ml药液+MH肉汤 14.88ml→5120 u /ml，分装4ml/支，-20℃保 存）。
抑菌效果的检测方法
抑菌效果的检测方法
另外，我们还可以从化学角度来考虑。
常见的抑菌效果检测方法包括最小抑菌浓度法和扩散法。
最小抑菌浓度法是将不同浓度的待测物溶液与一定数量的细菌接种在琼脂培养基上，培养一段时间后观察最低浓度的待测物能够抑制细菌生长。
扩散法是将待测物溶液加在琼脂培养基上，待其凝固后在琼脂上打孔，然后在孔中加入一定数量的细菌液，培养一段时间后观察抑菌圈的直径来评价抑菌效果。
此外，还可以从临床角度考虑。
在医药领域，抑菌效果的检测方法包括在体外和体内实验。
在体外实验中，可以使用培养皿法或微量稀释法来评价抗菌药物的抑菌效果。
在体内实验中，可以通过动物模型来评价抗菌药物的疗效和抑菌效果。
综上所述，抑菌效果的检测方法涉及微生物学、化学和临床等多个领域，不同的方法各有优劣，选择合适的方法取决于具体的实验要求和研究目的。
希望以上信息能够对你有所帮助。
实验六抗菌药物的体外药效试验
实验六抗菌药物的体外药效试验文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。
［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。
［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。
琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。
浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。
1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。
对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
抗生素体外抑菌实验实验报告
抗生素体外抑菌实验实验报告本实验旨在探究不同类型抗生素对某一细菌菌种的体外抑菌效果。
实验原理：细菌的体外抑菌实验是评估抗菌药物对细菌生长的影响的一种常见方法。
该实验通过在固体培养基上为细菌划线，将抗生素药物涂布在纸片上，再放置于已划好细菌的平板培养基上。
通过比较不同类型药物涂布的纸片与对照的空白纸片对细菌生长的影响，从而评价药物的抑菌作用。
实验步骤：1.选取一种目标细菌，本实验选用金黄色葡萄球菌。
2.准备好含有所需抗生素的培养基。
3.将目标细菌接种在平板培养基上并使其生长至对数生长期。
4.在平板培养基上划线并将贴有不同抗生素药物的纸片置于相应位置。
5.将培养基培养在恰当条件下，通常需要48小时，直到菌落在对照组与不同抗生素组之间的差异变得显著。
6.通过比较不同种类抗生素药物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果进行分析。
实验结果：利用本实验方法，我们测试了对金黄色葡萄球菌的八种不同类型的抗生素的体外抑菌效果。
实验结果表明不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。
其中，抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。
而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。
实验结论：通过本实验，我们得出了不同类型抗生素对某一细菌（金黄色葡萄球菌）的体外抑菌效果。
不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。
抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。
而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。
这些实验结果对于抗菌药物选择和用药方案的制定具有重要参考意义。
项目7药物体外抗菌试验技术
• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌 CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行， 生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
选择性培养基
❖ 阴性对照及阳性对照
1.
阴性对照
2.
阳性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无 菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应 用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。
❖ 抑菌试验
❖ 无菌检查法
❖
无菌检验结果判断
•
需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌
CMCC(B)28001
绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不
得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和 腔道的药品均不得检出活 螨
01
直接观察法：用肉眼直接 观察被检药物上有无白点 移动，再用放大镜或解剖 镜观察。
02
04
分离法：将药物放在特制分离器或附 有筛网的漏斗内，离药物６cm上放置 ６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h. 螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈 向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油 水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显 微镜下观察，根据其形态特征、足肢 游动情况判断是否为活螨。
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所 污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活 的霉菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。
实验七体外抑菌实验
（2）最低杀菌浓度（MBC）： 能够杀灭培养基中细菌的最低浓度。
意义： • 体外抗菌试验对临床用药具有参考价值。 • 鉴定新药是否具有抗菌活性。
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【试剂与器材】 细菌菌液（如金黄色葡萄球菌、链球
菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌）、药液（青 霉素、链霉素、磺胺嘧啶钠）、碘酒、牛 肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、高压 灭菌器、小试管、试管架、吸管、平皿等。
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【实验步骤】
一、试管二倍稀释法 取灭菌小试管10支，按照1至10编号，排列
于试管架上。按照无菌操作，从第一管到第10管， 分别加入牛肉膏汤1ml。用吸管吸取256μ/ml的青 霉素溶液1ml放入第一管，并反复吹匀；接着从第 一管吸出1ml放入第二管同样吹匀后吸出1ml放入 第三管，依次逐管进行稀释到第８管，第10管不 加青霉素液，作细菌对照组，第９管只加药物， 不加菌液，作为药物对照组。
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试管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
牛肉膏汤 （ml）
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
青霉素（ml） 1 1 1 1 1 1 1 1 1 弃1
葡萄球菌液 （ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0
0.5
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• １－８，１０管各加入培养18 h并用牛肉膏 汤稀释至5X１０７～ １０８ｃｆｕ／ｍｌ的 金黄色葡萄球菌菌液０．５ml。放入37℃培 养箱内培养24h后，取出观察细菌生长情况。
项目七 药物体外抗菌实验技术
只适用于同类消毒剂的杀菌效力测定,对非酚 类、季铵盐及不稳定的次氯酸盐等均不能给 予正确评价.
三、联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时 的相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液的 相互影响。
加强药物抗菌作用的为协同（synergism）；
减弱药物作用的为拮抗（antagonism）；
操作步骤
A 配置不同浓度的石碳酸稀释液、消毒剂稀释液
B
量取石碳酸和消毒剂稀释液于无菌试管中， 20℃恒温水浴
C 各管内依次加入伤寒杆菌或大肠杆菌培 养液0.5ml，管上标明5min处理、10min 处理字样，加入后准确计时。
D
到标定时间后取出一接种环的混合液接种于一 支5ml（或10ml）的肉汤培养基中，培养一定 时间后，观察并记录结果。+为有菌生长，-为 无菌生长。
原理：
药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药 区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性 不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
（1）滤纸片法（103页，3min）： 以倾注法制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置于平板上，
表1 石炭酸系数测定
浓度 5 作用时间 10 + + 15 -
石炭酸
消毒剂
1:90 1:100 1:110 1:150 1:170 1:200 1:225 1:250 1:275
+ + + +
根据5分钟不能杀菌，10分钟能杀菌的最大稀释度为标准计算： 石炭酸系数=250/100=2.5
注意事项
1 2 3 4 有机物存在时消毒剂容易失去活性; 消毒剂可能影响微生物生长; 随温度变化而影响测定结果;
样品体外实验报告
实验名称：某新型抗菌剂的体外抗菌活性研究实验日期：2023年3月15日实验目的：本研究旨在通过体外实验评估某新型抗菌剂对常见细菌和真菌的抗菌活性，为该抗菌剂在临床应用提供实验依据。
实验材料：1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白色念珠菌（Candida albicans）等。
2. 实验试剂：某新型抗菌剂原液、生理盐水、细菌培养基、真菌培养基、微量移液器、无菌操作台等。
3. 实验仪器：恒温培养箱、振荡培养箱、酶标仪、显微镜等。
实验方法：1. 菌株活化：将保存的实验菌株从冻存管中取出，接种于相应的培养基中，37℃恒温培养24小时。
2. 制备菌悬液：将活化后的菌株用生理盐水洗涤3次，调整菌液浓度为1×10^6 CFU/mL。
3. 实验分组：将实验分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，每组设置3个平行实验。
- 阴性对照组：生理盐水处理。
- 阳性对照组：已知抗菌活性药物处理。
- 实验组：某新型抗菌剂原液处理。
4. 抗菌活性测定：- 细菌实验：采用微量稀释法，将菌悬液与不同浓度的抗菌剂原液混合，置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
- 真菌实验：采用微量稀释法，将菌悬液与不同浓度的抗菌剂原液混合，置于25℃恒温培养箱中培养48小时，观察菌落生长情况。
5. 数据分析：采用GraphPad Prism 7软件进行统计分析，比较各组间差异，P<0.05为具有统计学意义。
实验结果：1. 细菌实验结果：- 阴性对照组：菌落生长良好。
- 阳性对照组：菌落生长受到抑制。
- 实验组：随着抗菌剂浓度的增加，菌落生长逐渐受到抑制，在较高浓度下，菌落生长完全被抑制。
2. 真菌实验结果：- 阴性对照组：菌落生长良好。
- 阳性对照组：菌落生长受到抑制。
- 实验组：随着抗菌剂浓度的增加，菌落生长逐渐受到抑制，在较高浓度下，菌落生长完全被抑制。
实验4 药物体外抗菌试验
K-B纸片法示意图
试验菌平板
庆
2.0cm
青
2.5cm
链
先
注意事项
1 以上各不操作要严格的无菌操作，镊子和L 棒都要用酒精烧过之后冷却再使用。 2 贴纸片的时候一定要一次把纸片定位好，接 触琼脂后就不能再移动含药滤纸片。 3 不同的抗菌药物其抑菌圈直径的敏感/耐药分 界点不一样；有的抗菌药物对不同的菌种的 分界点也不一致；应根据NCCLS最新公布 的分界点数据来读取药敏试验的结果。
2、连续稀释法
连续稀释法：人为配置连续梯度的药物 浓度来检测其抗菌能力，从而找出药物的 最小抑菌浓度。 最小抑菌浓度（MIC）：能抑制测试菌 生长的最低药物浓度即为MIC。 最小杀菌浓度（MBC）：能杀死测试菌 的最低药物浓度即为MBC。
试验测试(1h)
1、革兰氏染色 做好后请用油镜调好后举手示意 2、平板分区画线 做好后做好标记（学号）将平板扔到玻璃 缸中
微生物与免疫学实验
实验四 药物体外抗菌试验
琼脂扩散法 纸片法
连续稀释法
• 今天要用显微镜，请单学号同学去 领显微镜，双学号同学不用领
பைடு நூலகம்
1、 K—B纸片法（学生操作）
纸片法常用于测定试验菌对各种抗生素 的敏感性，所以又叫做药物敏感试验，在 临床上可作为选择用药的重要依据。
操作步骤
1 培养试验菌：将菌种斜面培养物移种到肉 汤培养液中，37℃培养过夜，使菌液浓度 约为1.5×108cfu/ml. 2 涂布试验菌：用无菌吸管吸取一滴菌液滴 加在MHA平板上，用无菌涂布棒（L棒）将 菌液在整个平板上涂布均匀。 3 贴含药的滤纸片：用无菌镊子贴加含药滤 纸片。 4 将平板倒置于37 ℃培养24h，观察结果， 测定抑菌圈的大小，并对照NCCLS的解释 标准来判断试验菌的药敏性。
抗生素体外及体内抑菌效应检测的实验综述报告
抗生素体外及体内抑菌效应检测的实验综述报告
抗生素体外及体内抑菌效应检测是抗生素研究中最常用的实验技术，它可以用来评估抗生素抑制菌的程度。
主要包括体外试验和体内试验两部分。
体外实验主要有浓度效应曲线法、磷酸盐抗性测定法、Minimal Inhibitory Concentration（MIC）分析法和Mueller-Hinton法。
这些方法可以确定抗生素对待测菌的最小抑制浓度。
体内抑菌效应实验主要有咪唑类菌的试验室动物模型、抑菌作用的动物试验室模型和免疫功能障碍实验室模型。
这些实验都可以评估抗生素对各种病原微生物的抑制作用。
总而言之，抗生素体外及体内抑菌效应检测是衡量抗生素作用的重要方法，为临床药物的使用提供依据。
体外抑菌实验报告
为了评估不同抗生素药物的抗菌能力，本实验通过体外抑菌实验，观察并记录抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等常见细菌的抑菌效果，以期为临床合理用药提供参考。
二、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。
2. 药物：头孢克洛、氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、红霉素等。
3. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、M-H肉汤培养基。
4. 实验器材：培养皿、移液器、无菌试管、锥形瓶、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等。
三、实验方法1. 菌株培养：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24小时。
2. 药物制备：将抗生素药物溶解于M-H肉汤培养基中，制成不同浓度的药物溶液。
3. 抑菌实验：将培养好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板。
将不同浓度的药物溶液滴加于平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈直径。
4. 数据记录：记录不同浓度药物溶液的抑菌圈直径，计算抑菌率。
四、实验结果1. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为18mm、15mm、13mm。
2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为12mm、10mm、5mm。
3. 阿莫西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为10mm、8mm、4mm。
4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为20mm、18mm、16mm。
5. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为14mm、12mm、6mm。
1. 头孢克洛、庆大霉素等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果，可作为临床治疗此类细菌感染的首选药物。
2. 氨苄西林、阿莫西林等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，但对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，临床应用时需注意。
体外抗菌实验实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外抗菌实验，探究不同抗生素对特定细菌的抑菌效果，为临床用药提供参考依据。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等。
2. 抗生素：青霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、左氧氟沙星等。
3. 培养基：营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂等。
4. 实验器材：培养皿、培养箱、无菌操作台、移液器、微量滴定板、显微镜等。
三、实验方法1. 菌株培养：将实验菌株接种于营养肉汤中，37℃恒温培养18小时，制成菌悬液。
2. 抗生素配比：根据抗生素说明书，将抗生素配制成不同浓度的溶液。
3. 平板涂布法：将菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板上，待菌落生长后，用无菌移液器吸取抗生素溶液，滴加于平板上，使其形成直径约10mm的抑菌圈。
4. 观察结果：将平板放入培养箱中，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。
5. 数据处理：记录抑菌圈直径，计算抑菌率。
四、实验结果1. 青霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直径为15mm。
2. 头孢唑啉对大肠杆菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为12mm。
3. 头孢他啶对肺炎克雷伯菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为13mm。
4. 阿莫西林对铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径为11mm。
5. 左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌均有一定的抑菌效果，抑菌圈直径分别为14mm、10mm、12mm、9mm。
五、实验讨论1. 本实验结果表明，不同抗生素对特定细菌的抑菌效果存在差异，可能与抗生素的药理作用和细菌耐药性有关。
2. 青霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳，可能是由于金黄色葡萄球菌对青霉素的敏感性较高。
3. 头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、左氧氟沙星等抗生素对其他细菌也有一定的抑菌效果，可根据临床需求选择合适的抗生素进行治疗。
4. 本实验采用平板涂布法进行体外抗菌实验，操作简便，结果可靠，但仅限于体外实验，临床应用时还需结合患者具体情况和细菌耐药性进行综合判断。
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《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
机体内的微生物代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可以形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。
机体内各组织中药物的吸收、分布不同，使药物的浓度难以恒定。
因此在评定新药的药效时除做体外抑菌实验外还需要做体内的抗菌实验。
二、实验材料及方法1.材料（1）菌株大肠杆菌（Escherichia coli）EC40菌株。
（2）用具灭菌培养皿（9 cm），灭菌三角烧瓶（250 mL），灭菌枪头（蓝、黄），灭菌离心管(EP管)，灭菌棉签，镊子，涂布器，氯霉素，苯唑西林，庆大霉素及复方新诺明（SXT），左氧氟沙星（LEV），庆大霉素（CN），苯唑西林（OXA）纸片。
（3）培养基① LB液体培养基：蛋白胨1.0 g ,酵母膏 0.5 g,NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，pH 7.2，高压灭菌0.1 Mpa,20 min。
②LB固体培养基：蛋白胨1.0 g ,酵母膏 0.5 g,NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，琼脂粉2.0 g，pH 7.2，高压灭菌0.1 Mpa,20 min。
2.实验步骤（1）实验器具的准备、灭菌，培养基的配制、处理（2）菌液制备挑取少量大肠杆菌40菌株，接种于LB液体培养基中，置37℃过夜培养。
第二天将菌液按1:10稀释备用。
（3）体外抑菌实验A. MIC法检测不同抗生素对大肠杆菌的最小抑菌浓度a.上述制备好的菌群稀释液与LB培养基按1:100稀释。
b.取无菌EP管27支，分成3排，第1排9支，第2排9支，第2排9支。
每一排中，除第1管加入1 ml LB培养基外，其余每管加入LB培养基0.5 ml。
c.向第1排第1管加入抗菌药物苯唑西林（苯唑西林浓度为160 mg/ml）100ul混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5 ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
d.向第2排第1管加入抗菌药物氯霉素（氯霉素初始浓度为15 mg/ml）4ul 混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
e.向第3排第1管加入抗菌药物庆大霉素(庆大霉素初始浓度为10mg/ml)4ul混匀，然后吸取0.5 ml至第2管，混匀后再吸取0.5 ml至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.5ml弃去，第9管为不含药物的生长对照。
f.然后置37℃培养箱培养24h，待观察。
B.纸片法检测不同抗生素对大肠杆菌的抑菌圈：a. 将制备好的LB琼脂平板底面用记号笔划线平均分成4份，然后用灭菌好的棉签试子蘸取上述制备好的菌群稀释液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。
用棉签试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60˚，最后沿平板周边绕两圈，保证涂布均匀。
b. 待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴抗生素滤纸片。
用无菌镊子取纸片一张，贴在琼脂平板每份的中央（注：LEV与SXT对称放置，OXA与CN对称放置）。
用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。
置37℃培养箱培养24h，待观察。
（4）体内抗菌实验全血材料制备及细菌培养实验取无菌试管三支，分别加入1 ml的血。
向其中两支试管中分别加氯霉素10 ul（氯霉素浓度为1.5mg/ml）和苯唑西林10 ul（苯唑西林浓度为16 mg/ml）然后向三支试管中分别加入10 ul的上述菌群稀释液。
置37℃摇床振荡培养。
（记为0 h）（5）体内抗菌实验1）培养约4h的全血及细菌混合液处理a.取无菌EP管9支，放三排，每排3支，分别标记为1（10-1）、2（10-2）、3（10-3）。
然后向每支EP管中加入900 ul无菌水。
b.将上午培养的全血及细菌混合液取出（此时已培养约4h）。
c.向第1排第1管加入含氯霉素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
d.向第2排第1管加入含苯唑西林的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
e.向第3排第1管加入无抗生素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
f.取制备好的LB琼脂平板三组共9个，每组3个，分别记为1（10-1）、2（10-2）、3（10-3）。
分别取含氯霉素的相应浓度的稀释液、含苯唑西林的相应浓度的稀释液和无抗生素的相应浓度的稀释液100 ul，按顺序依次涂布于上述三组平板中，分别标记为氯霉素组、苯唑西林组和无抗生素组。
g.待平板晾干后，置37℃培养箱静置培养16-20h。
2）培养约12h的全血及细菌混合液处理a.取无菌EP管12支，放三排，每排4支，分别标记为1（10-1）、2（10-2）、3（10-3）、4（10-4）。
然后向每支EP管中加入900 ul无菌水。
b.将上午培养的全血及细菌混合液取出（此时已培养约12h）。
c.向第1排第1管加入含氯霉素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
d.向第2排第1管加入含苯唑西林的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
e.向第3排第1管加入无抗生素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
f.取制备好的LB琼脂平板三组共9个，每组3个，分别记为2（10-2）、3（10-3）、4（10-4）。
分别取含氯霉素的相应浓度的稀释液、含苯唑西林的相应浓度的稀释液和无抗生素的相应浓度的稀释液100 ul，按顺序依次涂布于上述三组平板中，分别标记为氯霉素组、苯唑西林组和无抗生素组。
g.待平板晾干后，置37℃培养箱静置培养16-20h。
3）培养约24h的全血及细菌混合液处理a.取无菌EP管12支，放三排，每排4支，分别标记为1（10-1）、2（10-2）、3（10-3）、4（10-4）。
然后向每支EP管中加入900 ul无菌水。
b.将上午培养的全血及细菌混合液取出（此时已培养约24h）。
c.向第1排第1管加入含氯霉素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
d.向第2排第1管加入含苯唑西林的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
e.向第3排第1管加入无抗生素的混合液100 ul混匀，然后吸取100 ul 至第2管，混匀后再吸取100 ul至第3管，如此连续稀释至第4管。
f.取制备好的LB琼脂平板三组共9个，每组3个，分别记为2（10-2）、3（10-3）、4（10-4）。
分别取含氯霉素的相应浓度的稀释液、含苯唑西林的相应浓度的稀释液和无抗生素的相应浓度的稀释液100 ul，按顺序依次涂布于上述三组平板中，分别标记为氯霉素组、苯唑西林组和无抗生素组。
g.待平板晾干后，置37℃培养箱静置培养16-20h。
（6）观察上述各个实验的结果，记录、分析并完成实验报告。
1）体外抑菌试验结果观察及分析2）4h体内抑菌试验结果的统计及分析3）12h体内抑菌试验结果的统计及分析4）24h体内抑菌试验结果的统计及分析三、实验结果1.记录体外抑菌实验的MIC（最小抑菌浓度）值并拍照保存（附图片）2.记录抑菌圈大小（mm）并拍照保存（附图片）3.根据结果1、2，对细菌的药物敏感性进行判断（用√钩选）4.记录体内抗菌实验各时间点三个实验组的存活菌落数，并以时间为横坐标、以菌落数为纵坐标，画图比较。
A.记录4h时，三个实验组的存活菌落数并拍照保存（附图片）B.记录12h时，三个实验组的存活菌落数并拍照保存（附图片）C.记录24h时，三个实验组的存活菌落数并拍照保存（附图片）5.请根据结果4的数据，按下图例所示，以取菌时间点为横坐标，存活菌落数为纵坐标，进行作图。
10-2，10-3，10-4三个稀释度分别做出3个图进行比较。
图例稀释度为10-2时，4h，10h和24h的三组实验的存活菌落数四、实验总结与心得体会根据你在本次综合实验中的操作过程与实验结果，对自己获得的数据进行分析，并总结与实验成败相关的注意事项与心得体会。