酚氯仿抽提法

求助】PBS-酚/氯仿抽提法提取的DNA方法

大家能介绍一下PBS-酚/氯仿抽提法提取DNA的方法吗, 我们实验室没有钱买试剂盒, 还

得自己配试剂, 谢谢!!

你是提取细胞的还是血液的？

PBS是洗涤样品的作用吧，我用酚/氯仿抽提法提过DNA，与试剂盒比较起来，总体感觉是浓度大但是纯度不是很纯，但是做PCR的话是能购满足条件得，如果说要做酶切等操作

的话，最好还是用试剂盒抽提

以下方法可供你参考，祝你好运

细胞DNA的提取

PBS洗涤离心2次，弃上清，加入400 μL裂解液（100mg· L－1蛋白酶K，10mmol·L-1 Tris-HCI，15 mmol·L-1 NaCl，10mmol·L－1 EDTA，4g·L－1SDS pH8.0），重悬细胞，37℃保温12～24h。加450μL平衡酚，混匀，5000 g离心10min．转移上层水相，重复酚抽提1次．转移上层水相，加入450μL氯仿：异戊醇（24：1），混匀，5000g 离心10min。转移上层水相，加入1／10体积3mol·L－1乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积无水乙醇，混匀．置—20℃1h后，IO000g离心15min。以700mL·L－1乙醇洗涤2次，晾干后，加入50μLTE，－20℃保存备用．

血液提DNA

①300ul抗凝全血加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

②去上清液，加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。

③去上清液，加500ul消化Buffer（100mg· L－1蛋白酶K，10mmol·L-1 Tris-HCI，

15 mmol·L-1 NaCl，10mmol·L－1 EDTA，4g·L－1SDS pH8.0），充分混匀，56℃

水浴5h以上。

④加500ul 25:24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

⑤取上清液，加等量的25:24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。

⑥取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀。（未见沉淀提示

DNA量不多）

⑦15000rpm离心3min。

⑧去上清液，加500ul 70%的乙醇，充分混匀，15000rpm离心3min。

⑨去上清液，晾干，加50ul TE完全溶解备用。

我觉得酚/氯仿抽提法提取DNA还是可以的，除了开始做的少数几个标本，我一般提取的纯度没有低于1.8，甚至一些超过了2.0。不过，我们也不要完全相信仪器的数值，它只能

提供一个参考。

我做的方法是：

1 DNA提取（血液）

（1）加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min，弃上清；加400μlSTE，10%SDS 40μl，蛋白酶-K 10μl（10mg/ml）

（2）56度水如2小时，也可以37度消化过夜；不过后者我做的较少；

（3）等体积饱和酚，倒转摇匀。12000rpm 5分钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；

小心一点，不要吸入蛋白层；

（4）上清液加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），倒转混匀。12000rpm 5分

钟，离心，吸上层入另一1.5ml离心管；

（5）上清液加等体积氯仿：异戊醇（24：1），倒转混匀10分钟，12000rpm5分钟，

取上清入另一管；

（6）加1/12体积3M 醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4℃冰箱冷却后的无水乙醇，轻柔

振摇；然后你会看到白色絮状物（DNA）。

（7）-20℃放置20~30分钟，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，沉淀DNA，去上

清；可以直接倒掉；

（8）加1ml 70%乙醇洗涤，12000rpm 低温（4℃）离心10分钟，去上清，重复1

次；

（9）自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-20℃备用。

我觉得，在提取的时候，吸取上清要根据实际情况，不要有的上清不是很多而偏要定个统一的标准，只要提取的与加入的试剂成一定比例就可以了。否则，会影响实验结果的。不过，看到一个战友说“加入酚的液体分层抽吸上层液时，在避免吸入蛋白的前提下，要尽量把上层液吸多点，因为很多DNA就在两层中间；加入醋酸钠和预冷无水乙醇后，放置在－20度冰箱，时间长一点，2小时，以充分沉淀DNA。”

最好一次不要做得太多，容易出错。

2 DNA浓度的测定

取3ul DNA 标本加72μl 双蒸水，充分混匀后，用紫外分光光度计测定，计算浓度和比值，

判断DNA的浓度和纯度。

若DAN纯度<1.6, 表明有残存酚或蛋白含量太高，用氯仿抽提纯化就可以了。