发酵实验报告

综合性实验报告

实验名称：小型发酵罐的使用与发酵

过程中主要生化指标测定

实验性质：综合性实验

所属课程名称：发酵工程工艺原理

班级：2012级食品营养3班

学号：姓名：

实验指导教师：

实验时间：2014.12.01 – 2014.12.03

小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定

摘要：

关键词：

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

大肠杆菌（E.coli）

2.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，氯化钠5g，水1000mL。pH7.0。

发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000mL。pH7.0。

全部用自来水配制培养基。

2.1.3 其他材料

泡敌、斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。

2.1.4 设备

BIOTECH-7BGZ发酵罐1套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧(DO)电极、空压机及所

3 实验方法

3.1 流程

图1 发酵过程流程

3.2 菌种准备 3.2.1 配制培养基

配制种子固体培养基100mL ，分装试管，0.1Mpa （121℃）灭菌20min ，摆成斜面。 配制种子培养液600mL ，分别分装50mL 于两个250mL 三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL 平均分装于三个500mL 三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌备用。 3.2.2 接种与培养 （1）菌种活化

上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h 。 （2）接一级种

上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37℃振荡（125r/min ）培养12h 。分别测接种前和培养结束时的OD 值，计算出净增OD ，并作记录。 （3） 接二级种

将一级种转接二级种子，接种量5%。之后，37℃振荡（125r/min ）培养10h 。 3.3 上罐前的准备

洗净发酵罐及各联接胶管。

配制发酵培养基5000mL ，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 校正pH 电极和溶氧(DO)电极。

安装好发酵罐，把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水。 3.4 实罐灭菌

用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min ，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门

菌种

斜面一级种子（250mL 摇瓶二级种子

培养10h 37℃37℃)(500mL

发酵罐

管路准备 实罐灭菌

8～10h

取样

分析测定

S1，进行在位灭菌。

当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定在37℃，切入自动。灭菌完成后，关闭蒸汽发生器并排去蒸汽发生器内残汽。

当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。

连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量3～5L/min。

温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。

流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。

设定搅拌转速为300r/min、空气流量2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。

开启电脑，并与发酵罐主控设备相联。打开控制软件，做好实时监控和记录发酵全过程的准备。

3.5 发酵操作

3.5.1 取样

当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，开始取样（用于接种前培养基成分分析）：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧

J2、J3。

3.5.2 接种

将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定发酵液零时OD值。

3.5.3 电脑监控

打开电脑，启动软件，进行实时监控。

3.5.4 发酵管理

注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。(例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可用手动加入几滴消泡剂) 每小时取一次样，每次取样50mL。取样时，用量筒准确取流出的培养液50mL, 对号倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。

每小时记录发酵过程温度、pH、DO、通风、转速的数值，并记录操作情况。

3.6 发酵过程中各项生理指标的测定

3.6.1 OD值测定

均匀取样品5mL于编号试管中，用空白发酵液稀释至一定浓度，在721分光光度计上，根据菌体浓度与吸光度之间关系的标准曲线换算出菌体浓度。

测定A

600

其余发酵液于2000r/min条件下离心分离8min，上清液入编号三角瓶，用于测糖。3.6.2 葡萄糖测定

（1）样品处理

用蒸馏水对样品液进行稀释待用。

（2）标定碱性酒石酸铜溶液

分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10mL （甲、乙液各5mL）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）。

（3）样品溶液预标定

分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，控制在2min内加热至沸腾，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积。

（4）样品溶液测定

分别吸取5.0mL碱性酒石酸铜甲液和乙液，置于150mL锥形瓶中，加水10mL，加入玻璃珠2粒，混匀，从滴定管滴加比预滴定体积少1mL的样品溶液，使在2min内加热