高产纤维素酶菌株原生质体制备及再生条件
中性纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件
中性纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件
韩铭海;黄俊;余晓斌;缪静
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】2004(023)003
【摘要】通过紫外线和γ射线交替诱变,筛选得到一株高产纤维素酶的突变菌株BE40-39.与出发株相比,其产酶能力提高1.3倍,发酵性状与出发菌株也有明显的差异.突变菌株发酵试验发现,Avicel是突变菌株产酶最合适的纤维素质碳源.通过对发酵培养条件的试验,得出最佳培养条件是:Avicel质量浓度为0.1 g/dL,胰蛋白胨质量浓度为0.3 g/dL,最适发酵温度为30℃,最佳培养基初始pH 4.2,发酵5 d达到产酶高峰.
【总页数】4页(P85-88)
【作者】韩铭海;黄俊;余晓斌;缪静
【作者单位】江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214036;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214036;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214036;烟台师范大学生命科学院,山东,烟台,264025
【正文语种】中文
【中图分类】TQ925
【相关文献】
1.胆固醇氧化酶高产菌株的诱变选育及产酶条件优化 [J], 黄寅;葛飞;陶玉贵;汤斌;李英
2.N＋注入诱变选育纤维素酶高产菌株及发酵产酶营养因子优化研究 [J], 张宁;蒋剑春;杨静;卫民;赵剑;童娅娟
3.N+注入诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株及其产酶条件的优化 [J], 沈加成;朱明田;曲音波
4.产纤维素酶地衣芽孢杆菌的诱变选育及其产酶条件优化 [J], 余祖华;丁轲;侯奎;李元晓;李旺;刘一尘;曹平华;贾艳艳;程相朝
5.纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究 [J], 董志扬;祝令香;于巍;林敏;平淑珍
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一株高产纤维素酶菌的筛选及发酵条件优化
一株高产纤维素酶菌的筛选及发酵条件优化作者：柴明艳来源：《湖北农业科学》 2014年第13期柴明艳（淄博职业学院，山东淄博２５５３１４）摘要：采用羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ）－刚果红平板法，对富含腐烂玉米秸秆的土样进行纤维素酶产生菌的筛选及目标菌株发酵培养条件的优化试验。
结果表明，筛选分离出１０株产纤维素酶菌株，其中有３株菌株产酶效果较好，特别是菌株ｔｇ３１对玉米秸秆水解率高达３７．６２％，其最佳发酵工艺的温度为２８℃，发酵初始ｐＨ５．０，接种量６％，摇瓶转速１８０ｒ／ｍｉｎ，经５Ｌ罐放大试验，得出在１２０ｈ时其滤纸酶活力（ＦＰＡ）可达到１４．２１ＩＵ／ｍＬ。
关键词：纤维素酶；菌株；发酵；玉米秸秆；水解中图分类号：Q９３９．９６文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１４）１３－3141－０4中国是农业大国，每年产生的农作物秸秆总量超过７亿ｔ，约占世界秸秆总产量的１／３［１，２］，其中玉米秸秆产量高达２．２亿ｔ［３］。
玉米秸秆的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素等，难以被人类有效利用。
目前，中国玉米秸秆大部分被直接焚烧，不仅对环境造成了极大的污染，同时也浪费了大量的秸秆纤维素资源［４］。
为改变现状，开发纤维素酶降解玉米秸秆，实现废弃资源的生物利用，已逐渐成为该领域的研究热点之一。
纤维素酶可充分降解秸秆中的纤维素，将其转化为微生物可利用的糖类，大大提高玉米秸秆的经济利用价值，该技术在医药中间体、精细化工、食品、饲料及生物能源等领域都有广泛的应用前景［５，６］。
因此，展开高产纤维素酶菌株的选育、发酵工艺条件优化等研究工作，对纤维素的商业化开发具有重大意义。
本研究在玉米秸秆地进行针对性的取样筛选，获得一株高产、高玉米秸秆水解率的菌株，并对其产酶条件进行了摇瓶优化及５Ｌ罐发酵工艺放大，为玉米秸秆纤维素资源的产业化应用打下基础。
１材料与方法１．１材料１．１．１样品采集从辽宁省喀左县富含腐烂玉米秸秆地区取土样若干。
高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究
高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究邱静;罗水忠;姜绍通;郑志;杨培周【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(032)009【摘要】为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究.考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件:不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×10<'6>个/mL,再生率最高为6.8%.【总页数】5页(P174-178)【作者】邱静;罗水忠;姜绍通;郑志;杨培周【作者单位】合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽,合肥,230009【正文语种】中文【中图分类】Q935【相关文献】1.L-乳酸生产菌根霉菌的原生质体化及再生条件的研究 [J], 庄文容;陈海晏2.L-乳酸高产突变菌株一米根霉NAF-032菌种培养条件的研究 [J], 朱晓红;乔长晟;汤凤霞3.米根霉发酵甘薯淀粉制备L-乳酸的最适条件 [J], 李兴江;潘丽军;姜绍通;潘利华;郑志4.高产L-乳酸米根霉RE3303菌株特性研究 [J], 古绍彬;葛春梅;周秀红;姚建铭;潘仁瑞;余增亮5.离子注入选育高产L-乳酸的米根霉突变株及其酵特性研究 [J], 杨英歌;郑之明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。
选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。
以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。
这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。
2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。
3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。
4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。
5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。
以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。
纤维素酶高产菌株的选育
（Ｕ／ ）来 表 示 。 Ｉ ｍＥ １ ３ 抗 分 解代谢 阻遏 的 突 变株 的选 育过 程 ． １ ３ １ 诱 变处 理 过程 ．．
纤 维 素物 质 的酶 促水 解 具 有 良好 的应 用 前景 。但
是 ，目前所存在的主要问题是酶解效率不高。为提高 纤维素酶解 的效率 ，多采用选育高产纤维素酶菌种和 改变纤维材料的结构 ，提高对酶的敏感性的方法 。选 育优 良菌种是提高纤 维素酶活力的关键 。通常，从 自 然界 分 离筛 选 的野 生 型菌 株 其产 酶 能力 比较 低 。为提 高纤维素酶 活力 ，诱 变育 种是一 种有效 的方法 。 目
基础。
天～１ 天 ，液体培养 ６ ～８ 。 ０ 天 天
１ ２ 分析 方 法 ．
还 原糖 测 定 ：取 上清 液 ，按 照 Ｍｉｅ 方 法 ，使 用 ｌｒ ｌ ＤｉＳ试 剂 测定 还 原 糖 的含 量 。 以葡 萄糖作 为标 准 。 Ｎ 纤 维素 酶 活力 测定 ：采 用 Ｍａ ｄｌ方 法来 测 定 滤 ｎｅ ｓ 纸 酶 活 （ ｉｅ ａｅ ｔ ｉ ，简 称 为 Ｆ Ａ）和 Ｃ ＦｌｒＰｐｒ ｉ ｔ ｔ Ａｃ ｖ ｙ Ｐ ＭＣ 酶 活 （ ＩＣ’ｅ） 其 酶 活 力 单 位 用 国 际 单 位 ＣＶ ａ 。 Ｉ ｓ
菌糠中产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及增殖条件响应面法优化
物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奥博星有限公司提供。MgSO4 · 7H2 O、K2 HPO4 、KH2 PO4 、葡萄糖由天津福晨化学试剂厂提供。 1． 1． 3 培养基 牛肉膏蛋白胨液体培养基： 牛肉膏 3 g、蛋白 胨 10 g、NaCl 5 g、加 水补 足 至 1 000 mL，pH 值 7． 0 ～ 8． 0， 121 ℃ 灭菌 20 min，备用； 发酵产酶培养基： CMC － Na 10 g、 KH2 PO4 2 g、MgSO4 ·7H2 O 0． 5 g、蛋白胨 5 g、酵母粉 5 g，加 水补足至 1 000 mL，121 ℃ 灭菌 20 min，备用。刚果红筛选培 养基： CMC － Na 2 g、（ NH4 ） 2 SO4 2 g、MgSO4 ·7H2 O 0． 5 g、 K2 HPO4 1 g、NaCl 0． 5 g、刚果红 0． 4 g、琼脂 20 g，加水补足至 1 000 mL，pH 值 7． 0，121 ℃ 灭菌 30 min。 1． 2 试验方法 1． 2． 1 菌株筛选 1． 2． 1． 1 富集培养 菌糠中添加 2% 糖蜜、1% 硫酸铵、60% 水，于 30 ℃ 恒 温 培 养 箱 中 培 养 48 h。将 发 酵 后 的 菌 糠 按 1 ∶ 9 的比例置于生理盐水中，静置 30 min，5 000 r / min 离心 5 min，将离心后得到的菌悬液进行梯度稀释，涂布后于 30 ℃ 恒温培养箱倒置培养 48 h。 1． 2． 1． 2 产纤维素酶菌株初筛 将培养后的菌糠按 1 ∶ 9 的 比例溶于生理盐水中，5 000 r / min 离心 5 min，将离心后得到 的菌悬液 进 行 梯 度 稀 释，并 涂 布 于 刚 果 红 筛 选 培 养 基 上， 37 ℃ 培养 24 h 后放置 2 d，测量透明圈直径与菌落直径，挑 选出透明圈直径与菌落直径比值（ 简称圈菌比） 较大的作为 初筛菌株［6 － 7］，在刚果红初筛平板上进行划线分离纯化，并于 斜面保存菌种。 1． 2． 1． 3 产纤维素酶菌株复筛 将初筛得到的菌株接种到 产酶培养 基 中，于 37 ℃ 、160 r / min 培 养 48 h，后 于 4 ℃ 、 5 000 r / min 离心 10 min，测 定 上 清 液 的 羧 甲 基 纤 维 素 酶 活性［8］。 1． 2． 2 菌株鉴定 1． 2． 2． 1 形态学特征及生理生化鉴定 观察菌株的菌落形 态，革兰氏染色后观察菌株显微形态。利用细菌微量生化鉴
高产纤维素酶青霉菌的筛选和及产酶条件的研究
ａ ｄ Ｃｅｌ ｌ ｓ ｏ ｕ ｔ０ ｎ ｌ ｏ ｅＰｒ ｄ ｃ ｉ ｎ ｕ
ＨＵ Ｄａ ， Ｌ Ｕ Ｘｉ ， ＬＥＩ ｉ ｎ Ｉ ａ Ｊ
（ ｉ ０ ｙａｄＥ ｖｒｎ ｎａ ｅｇｎ ｅｉｇ Ｎａｃ ａｇＩｓ ｔｔｏ Ｔ ｃｎ ｌｇ ，ＮａＣ ａ ｇ３０ １， ｈ ａ Ｂ０ ｇ ｎ ｉ ｍｅｔ ｉｅｒ ， ｎ ｈｎ ｔｕｅ ｆ ｅｈ ｏｏ ｙ ｎ ｈｎ ３０ ３ Ｃ ｉ ） ｌ ｎ ｏ ｌｎ ｎ ｎｉ ｎ
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
ｄ ｉ ３ ６／ｉ ｎ１７ － ０ Ｘ２ １．１ ０ ５ ｏ：ｍ．９９ ．ｓ． ４ ５ ６ ． ００ － ０ ｉｓ ６ ０
丢糟 ，是在 固态 发 酵法 酿造 白酒 时 入窖 回糟 蒸 酒后 的酒醅 。 由于 丢糟含 有难 于消 化 的稻壳 ， 粗纤 维
素 的酶解 是 一个 复 杂 的过 程 ，其 真正 的酶解 机 制还 不 完全 清楚团 。 从 自然 中分 离 出 的纤 维 素 酶生产 菌纤维 素 酶活 力 一直 不 高 ， 了最 大 限度 的利 用丢 糟 中的 纤维 素 ， 为
Ｓ ｒ ｅ ｉ ｇ ａ ｄ Ｍ ｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｆＨｉ ｈ Ｃｅｌ ｌ ｓ ｔ ｉｙ Ｓ ｒ ｉ ｃ ｅ ｎ ｎ ｎ ｔ ｇ ｎ ｓｓｏ ｇ ｌ ａ ｅ Ａｃｉ ｔ ｔ ａ ｎ ｕ ｖ
Ｆ Ｎ ｈｎ －ｉｇ Ｙ Ｎ ａ－ ａ ， Ｉ Ｎ Ｚ ｉｗ ｉＬ ｉ － ｉｎ ， ＨＥ ｏ ｂｎ Ａ Ｇ Ｓ ａ ｇ ｌ ， Ａ Ｇ Ｄ ｎ ｄ ｎ Ｑ Ａ ｈ－ ｅ， Ｉ ａ ｑａ ｇ Ｃ Ｎ Ｍａ－ ｉ ｎ Ｘ ｏ
ｍ ｔ ｅｅｉ Ｔ ｅＣ ｎｙ ｃ ｖ ｙＷ ３２９ ｕｇｄｙｍ ｄｕ ｔｅＦ Ａ ｅ ｚｍｅａｔ ｉ Ｗ ０ ．１ ／ ｒ ｄｕ ｕａ ｎｓ ． ｈ ＭＣ ｅｚｍｅａｔ ｉ ａ １３ ． ／ ｒ ｅｉｍ、 Ｐ ｎｙ ｃ ｖ ｇ ｓ ｉｔ ｓ ｏ ｈ ｉ ￣ ａ ３ １ Ｕｇｄｙｍｅｉｍ ｓ ６
细菌纤维素高产菌株的诱变选育和发酵条件研究
细菌纤维素高产菌株的诱变选育和发酵条件研究汤卫华，李飞，贾原媛，贾士儒（天津科技大学工业微生物教育部重点实验室，天津300457）摘要：为了选育高产细菌纤维素的木葡糖酸醋杆菌（（Gluconacetobacter oboediens）突变菌株，通过硫酸二乙酯和氯化锂复合诱变，得到一株产细菌纤维素能力最高的突变菌株GO2，其细菌纤维素产量为9.91 g/L，比出发菌株提高36.5%。
同时确定突变菌株GO2的静置培养条件为发酵时间为6 d，接种量为8%(v/v)，面积/体积比为1.58~2.08 cm-1。
关键词：细菌纤维素；木葡糖酸醋杆菌；化学诱变；发酵条件中图分类号：Q93；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)09-1016-04Screening and Fermentation Conditions of Strains from Gluconacetobacter oboediens for High-yield Bacterial Cellulose ProductionTANG Wei-hua, LI Fei, JIA Yuan-yuan, JIA Shi-ru（Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, P. R. China.）Abstract: The bacterial cellulose (BC)-producing strain (Gluconacetobacter oboediens) was mutagenized with diethyl sulphate (DES) and lithium chloride (LiCl), and the mutants of strain GO, namely GO2, was obtained. The BC production by GO2 (9.91 g/L) was about 1.365-fold higher than that of the original strain. The optimum fermentation conditions were determined as follows: fermentation time of 6 days, inoculation volume of 8%(v/v) and area/volume ratio of 1.58-2.08 cm-1.Key words: Bacterial cellulose; Gluconacetobacter oboediens; chemical mutagenesis; fermentation conditions细菌纤维素因其具有高结晶度、高化学纯度、高抗张强度、高弹性模量、高持水性等独特的性质，在食品、医药、造纸行业均有巨大的应用潜力[1]，但由于细菌纤维素产率低，而造成生产成本高，使其仅用于高附加值产品。
产纤维素酶细菌的筛选及培养
产纤维素酶细菌的筛选及培养一、筛选步骤1、菌种的采集采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。
2、菌种初筛（1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。
将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。
（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）1.000mL加入1号试管，加无菌水9.000mL。
混匀后吸取1.000mL 加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。
（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。
（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。
（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。
（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。
（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。
3、菌种复筛（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。
二、培养方法1清洗实验器具2灭菌3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床）5稀释菌样6涂布平板或平板划线7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了8观察记录（数量、分布等）三、培养基种类及其组成1、初筛CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。
原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
原生质体紫外诱变选育纤维素酶高产菌株
摘 要 ： 以绿 色木 霉 Ｔ 为 出发 茵株 ， 其 进 行 原 生质 体 紫外 诱 变 ， 过 刚 果 红 透 明 圈平 板 初 筛 和 油 菜籽 皮 固 态 发 酵 ０ 对 通
复 筛 ， 到 株 稳 定 性 好 的 纤 维 素 酶 高 产 茵 株 Ｕ ， ＣＭＣ 酶 活 达 到 了 １ ２ ． ４ Ｕ ・ｇ 。 比 出 发 茵 株 Ｔ 提 高 了 得 ＶＴ 其 ０ ０ ２ ＿， ０
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原 生 质体 紫外 诱 变选 育 纤 维 素 酶 高产 菌 株
胡婷 婷 。 雁 临 邱 （ 北工业 大 学生物工 程 学院 ， 湖 湖北 武 汉 ４ ０ ６ ） ３ ０ ８
ＫＨ２ Ｏ４０ ４ ， Ｓ ． ４ ， ａ １ ０ ０ ， 量 ． Ｍｇ Ｏ４０ ０ Ｃ Ｃ ２ ． ５ 装 Ｐ
５ 。
ｍａ是 产纤 维素 酶 最 高 的菌 种 ［ ］ 目前 ， 少 学者 利 ７ 。 不
用 各种诱 变 剂 处 理 孢 子 来 选 育 高 纤 维 素 酶 活 的突 变
按 牛酶 、 ． 溶 蜗 溶 壁 酶 ， 高 渗 缓 冲 溶 液 中充 分 溶 解 ， １ ０ 于 经 ００ ０ｒ・ ｍｉ－ 离心 １ ｎ后 ， 上 清液 置 ３ 紫 外 灯 下处 ｎ１ ０ ｍｉ 取 ０ｗ 理 ３ ｎ 倒 人 已灭 菌 的 带 有 小 玻 璃 珠 的 小 三 角 瓶 ０ｍｉ ，
株， 但是 通过 原生 质体 诱 变选 育 优 良菌株 的报 道 还很
少 。由于去除 了细胞 壁 ， 生质 体对 诱变剂 更加 敏感 ， 原 更 容易得 到优 良的 突变 株 ， 因此 ， 者 对 出发 菌株 Ｔ 作 。 进行 原生 质体紫 外诱 变 ， 得 了较好 的效果 。 取
纤维素酶生产工艺
纤维素酶生产工艺
近年来，生物技术的发展使得纤维素酶生产工艺得到了显著的提高。
纤维素酶是一种可以分解纤维素为可利用的糖类的酶，具有重要的应用价值。
下面将介绍一种具有高产纤维素酶的工艺流程。
首先，纤维素酶的生产需要选取合适的微生物发酵菌株。
一般来说，厌氧发酵菌株比较适合纤维素酶的产生，因为这些菌株在无氧条件下能够产生较多的纤维素酶。
目前常用的菌株有霉菌和细菌。
其次，培养基的配方非常重要。
为了提高产酶菌株的生长和产酶能力，需要选择适宜的碳源、氮源和微量元素。
纤维素酶的产量主要取决于培养基中纤维素的浓度，因此合理控制纤维素的添加量能够提高产酶效果。
然后，培养条件的控制对于纤维素酶产量的提高也很关键。
温度、pH值、氧气供应等条件都会影响菌株的生长和产酶能力。
通常来说，霉菌的适宜生长温度为30-35度，而细菌则适宜在30-37度进行培养。
pH值通常在5-7之间能够提高产酶效果。
最后，培养过程中的过滤和分离工艺对提高纤维素酶产量也非常重要。
培养液中的菌体和杂质需要通过过滤和分离操作进行分离，以获得纤维素酶的纯净产物。
常用的过滤和分离技术有超滤和离心等。
综上所述，纤维素酶的生产工艺是一个复杂而重要的过程。
通
过选择合适的菌株、优化培养基配方、调控培养条件以及完善的过滤和分离工艺，可以提高纤维素酶的产量和品质，为纤维素酶的应用提供更好的基础。
同时，随着生物技术的不断发展，相信纤维素酶的生产工艺将会得到进一步的改进和提高。
里氏木霉40359原生质体制备条件研究
ｄ ｅ ｔｓ （％ ） ｎ ｅｌａ ｅ （％ ） Ｔ ｅ ｐｏｏ ｌ ｔ ｆｒ ｔ ｎ ｎ ｍｂ ｒｗ ｓ６１ １ ５ ｍ ａ ｄ ｔｅ ｉｓ ｅ ２ ｇ ａ ａ ｄ ｃ ｌｌ ｕ ｓ ２ ． ｈ ｒｔｐ ｓ ｏｍａｉ ｕ ｅ ａ ． ｘ ０ ・ ｎ ｈ ａｓ ｏ ４
及 浓度、酶解温度 、酶解 时间、再 生培 养基 的稳 渗刺进行 了 究。结果表 明 ：当茵龄 为 １ ，采 用 ２ 研 ２ｈ ％纤维素酶
和２ ％蜗牛酶混合液 ，酶 解温度 ３ ０℃，酶解时 间 ２ｈ ，用 ０６ｍ ｌＬ ． ｏ・ 蔗糖作再 生培养基 的稳渗 剂 ，原生质体 的形
成数 为 ６１ｘ ０ 个 ・ － ．４ ｌ５ ｍＬ 。原 生质 体 再 生率 为 １．％。 ０６
关键 词：里氏木霉；原 生质体 ；原生质体形成与再生
中图分类号：￥ ８ ． ４ ２４ 文献标志码：Ａ 文章编号 ：１０ — ３ ９ ２ １） ８ ０ ０ － ４ ０ ５ ９ ６ （０ １０ － １８ ０
Ｐｒ ｔ ｐａ ｔ ｒ ｐ ｒ ｔ ｎ ｎ ｒ ｈ ｄ ｒ ｅ ｓ ｉ４ ３ ９Ｚ Ａ Ｇ Ｘａｘａ’ Ｉ ｏ ｏ ｌｓ ｐ ｅ ａ ａ ｉ ｉ Ｔ ｉ ｏ ｅ ｍａ ｒ ｅ ｅ ０ ５ ／Ｈ Ｎ ｉ ｕｎ ｏ ｃ ｏ 。Ｌ
第４卷 第８ ２ 期
２１年 ８ ０１ 月
东
北
农
业
大
学
一种纤维素酶的制备方法
一种纤维素酶的制备方法纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶类，在生物质转化、纤维素生物降解等领域具有广泛的应用价值。
下面将介绍一种常见的纤维素酶制备方法。
首先，制备纤维素酶的第一步是筛选纤维素酶产生菌株。
常见的纤维素酶产生菌株包括木质纤维素纤维化细菌、泥炭分解菌、拟杆菌等。
根据研究目的和实验条件，选择适合的菌株进行筛选。
其次，制备纤维素酶的第二步是培养产酶菌株。
将筛选到的产酶菌株进行培养，一般使用液体培养基或固体培养基。
液体培养基一般包括碳源、氮源、矿质盐和适宜的pH、温度等条件。
固体培养基一般是利用纤维素作为唯一的碳源，在土壤中加入适量的无菌水，培养酶解的环境。
在培养过程中，需要优化培养条件，如温度、pH、离子浓度等，以提高产酶菌株的活性。
第三步是收集和提取纤维素酶。
培养一定时间后，将发酵液进行分离。
液体培养基可通过离心、过滤等方式分离，固体培养基可通过搅拌和离心等方式分离。
所得的酶液需要对酶进行纯化和浓缩，以便应用于实际工业生产中。
纤维素酶的纯化方法有很多种，常用的有醇沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤法等。
这些方法可以根据酶的物理化学特性选择适合的方法进行纯化。
在纯化和浓缩的过程中，通常需要进一步对酶的活性进行测定，并进行酶动力学特性的研究。
这对于酶的性质和应用具有重要意义。
最后，对纯化和浓缩后的纤维素酶进行保存和应用。
纯化后的酶液可以通过冷冻或冻干等方式进行保存。
在应用中，可以将纤维素酶添加到需要进行纤维素降解的废弃物中，并优化反应条件，使酶的降解效率和产酶量达到最佳。
总之，纤维素酶的制备方法包括菌株筛选、产酶菌株培养、酶液分离与提取、纯化与浓缩等步骤。
这些步骤需要根据实际需求和条件进行优化，以提高纤维素酶的产量和活性，为生物质转化、纤维素降解等领域的应用提供支持。
纤维素酶高产菌株的筛选及最适产酶条件
纤维素酶高产菌株的筛选及最适产酶条件许明;沈进军;吕春娥;张顺萍;赵剑锋;薛勇;程祖锌【摘要】从本实验室保存的57株菌株中筛选出一株可高效降解纤维素的纤维素酶高产菌株哈茨木霉APS62,其滤纸酶活力(FPA)为4.981 IU·g-1,是对照里氏木霉模式菌株APS63的3.02倍.产酶条件优化研究的结果表明,以稻草粉为底物,APS62菌株产滤纸酶的最适条件为:培养温度28 ℃,培养时间3 d,稻草粉与麸皮比5∶ 0,接种量6%,氮源为NH4NO3(总氮量0.4%),培养基起始pH为5.0,吐温80含量0.1%.此条件下的FPA为6.125 IU·g-1,比优化前提高8.10%.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(039)006【总页数】6页(P628-633)【关键词】纤维素酶;哈茨木霉APS62;筛选;产酶条件【作者】许明;沈进军;吕春娥;张顺萍;赵剑锋;薛勇;程祖锌【作者单位】农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所;农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所;福建农林大学生命科学学院;农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所;福建农林大学生命科学学院;福建农林大学生命科学学院;福建农林大学菌物研究中心,福建,福州,350002;农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所;福建农林大学生命科学学院;农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所;福建农林大学生命科学学院;农业部海峡两岸农业技术合作中心;福建农林大学农产品品质研究所【正文语种】中文【中图分类】TQ925纤维素是地球上最丰富的可再生性资源之一,占地球总生物量的 40%,但由于降解较难,目前绝大部分没有得到很好利用,造成巨大的浪费[1-4].如何更为有效地转化和利用这一丰富资源,已受到许多国家的关注.研究发现,纤维素原料可以用来生产乙醇,而乙醇是一种能替代有限石油资源的能源,其转化主要有 2个过程,即纤维生物质中的纤维素被纤维素酶降解生成还原糖及还原糖发酵后生产乙醇[5-6].目前,由于纤维素酶的活性和稳定性水平使得其生产成本过高从而阻碍对生物质的水解应用,制约其产业化的实现.因此,筛选纤维素酶活力高的菌株,对纤维类资源的利用具有重要意义.本试验筛选到一株具有纤维素酶活力高的菌株哈茨木霉 APS62,并对其产酶条件进行了研究.57株纤维素分解菌（表 1）均由本实验室保存.马铃薯葡萄糖琼脂培养基:200 g马铃薯（去皮）、20 g葡萄糖、20 g琼脂粉,用水定容至 1 L.基础固体产酶培养基:4 g稻草粉、1 g麸皮、15 m L无机盐培养液（含4 g◦ L-1 KH2 PO4、16 g◦L-1（NH4）2 SO4、1 g◦ L-1 MgSO4）[7].将 57株菌株分别取 2环接种到装有 10 mL生理盐水的三角瓶中,于150 r◦min-1、28℃震荡 12 h,制得孢子悬液.向培养 3 d的固体酶曲中加入 100 mL蒸馏水,震荡均匀,于50℃恒温水浴 10 min,室温下静置 50 min.用 2层脱脂棉挤滤,滤液于5000 r◦min-1、4℃离心 10 min,上清液即为粗酶液.将 57株菌株分别取 2环接种到装有 10 mL生理盐水的三角瓶中,于150 r◦min-1、28℃震荡 12 h,以10%的接种量接种到稻草粉固体产酶培养基上,置28℃生化培养箱中培养 72 h,提取粗酶液并测定酶活力,每个处理重复 3次.以购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的里氏木霉模式菌株 APS63为对照.1.6.1 培养时间对酶活力影响的试验将筛选的最优菌株的菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体产酶培养基上,置28℃培养,每隔 1 d测定酶活力,每个处理重复 3次.1.6.2 接种量对酶活力影响的试验取培养 12 h的菌孢子悬液按 2%、6%、10%、14%的接种量接种到固体发酵培养基上,培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复 3次.1.6.3 稻草粉与麸皮比对酶活力影响的试验固体发酵培养基以稻草粉为底料,将稻草粉与麸皮按不同比例混合,菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,置28℃培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复 3次.1.6.4 不同氮源对酶活力影响的试验以（NH4）2 SO4、NH4 NO3、蛋白胨、酵母膏作为氮源.菌孢子悬液按10%的接种量接种到固体发酵培养基上,在培养基中分别添加上述氮源（总氮量为 0.4%）,置28℃培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复3次.1.6.5 培养温度对酶活力影响的试验将菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,分别于28、30、32℃下培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复 3次.1.6.6 培养基起始 pH对酶活力影响的试验将菌孢子悬液按 10%的接种量接种到起始 pH不同的固体发酵培养基上,置28℃培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复 3次.1.6.7 吐温 80对酶活力影响的试验以吐温 80为表面活性剂.将菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,在培养基中添加 0.1%-0.7%吐温 80,以不添加为对照,置28℃培养 3 d后测定酶活力,每个处理重复 3次.以滤纸酶活力（filter paper activity,FPA）表示纤维素酶的总活力,按照国际理论和应用化学协会（IUPAC）推荐的国际标准方法测定[8],以国际单位 IU表示.试管中放入一条1 cm×6 cm Whatman No.1滤纸（约 50mg）,加入 0.5m L适当稀释的纤维素酶和 1.5m L柠檬酸缓冲液（pH 4.8）,置50℃水浴 60 min.空白试验中除酶液事先灭活外,其余条件不变.反应结束后用 3,5-二硝基水杨酸法测定所得的还原糖含量.FPA国际单位（IU）等于酶促反应中每分钟生成1μmol葡萄糖（用还原糖表示）所需的酶量.从表 1可以看出,APS35、APS11、APS62、APS20、APS42、APS28、APS61、APS18、APS10、APS69、APS19、APS56、APS24、APS21、APS30、APS51等 16株菌株的 FPA均是对照 APS63菌株 FPA的 2倍多,且与对照间的差异均达显著水平.APS35、APS11、APS62、APS20菌株的FPA分别比对照高258.72%、208.54%、202.47%、193.91%.哈茨木霉 APS62菌株排在第 3位,但由于其生长周期短,而且菌株性质优良、退化慢,因此选其作为最优菌株.从木霉、曲霉、细菌三大类菌中各取前 4名菌株作方差分析,结果（表 2）表明,木霉是纤维素酶活力高菌株的主要来源,且与曲霉和细菌酶活力的差异达极显著水平将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体产酶培养基上,于28℃培养,每隔1 d测定 FPA.结果（图 1）表明:在起初的 2 d内,FPA增加幅度较大,培养到第 2天时,FPA最大,为4.130 IU◦ g-1;3 d后 FPA开始下降,第 5天的 FPA只有高峰期的 64.5%.可见,培养时间以 3 d为宜.取培养12 h的 APS62菌孢子悬液按 2%、6%、10%、14%的接种量接种到固体发酵培养基上,培养3 d后测定酶活力.结果（图 2）表明,接种量对 FPA有很大影响.接种量为 6%时,FPA最高,培养基能为菌体提供比较充足的营养;接种量过低,营养过剩,菌丝体徒长,产酶滞后;接种量过大,则菌丝体增长迅速,后期营养不良,且温度升高,不利于产酶.可见,最适接种量为 6%.将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,固体发酵培养基中的稻草粉与麸皮按不同比例混合,置28℃培养 3 d后测定酶活力.结果（图 3）表明,稻草粉与麸皮比为5∶0时的 FPA最高.麸皮增加后,FPA反而降低.可能是由于微生物在利用碳源时,首先利用麸皮中的淀粉类,而后才利用稻草中纤维素的缘故.此结果与徐昶等[7]的研究结果不一致.将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,在固体发酵培养基中分别添加（NH4）2 SO4、NH4 NO3、蛋白胨、酵母膏（总氮量为 0.4%）,稻草粉与麸皮比为4∶1,置28℃培养 3 d后测定酶活力.结果（图 4）表明,氮源对FPA的影响大小依次为 NH4 NO3、（NH4）2 SO4、有机氮,NH4 NO3作为氮源的效果最好.将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,于不同温度下培养 3 d后测定酶活力.结果（图 5）表明:APS62菌株在较低温度（25℃）下培养,菌体产酶量低,孢子数量少,呈浅绿色;在较高温度（32℃）下培养,菌体生长旺盛,孢子多,呈绿色,FPA开始降低.可见,菌株产酶比较适宜的温度为28℃.将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到起始 pH不同的固体发酵培养基上,置28℃培养 3 d后测定酶活力.结果（图 6）表明,培养基的最适起始 pH为 5.0. 将 APS62菌孢子悬液按 10%的接种量接种到固体发酵培养基上,在培养基中添加不同含量的吐温80,置28℃培养 3 d后测定酶活力.结果（图 7）表明,加入 0.3%吐温 80能促进菌体产酶,表明一定含量的吐温 80能提高细胞质膜的通透性,有利于胞内酶的不断排出.但吐温 80含量过高菌体酶活力则下降,可能是菌体受到伤害,产酶下降.综合上述单因素试验结果,采用正交法得出 APS62菌株在固体培养基上产酶的最佳条件.选择培养温度、吐温 80、NH4 NO3和稻草与麸皮比 4个因素,每个因素取 3个水平.选用 L9（34）正交设计,测定FPA,试验结果见表 3.为判断上述 4个因素对试验结果的影响是否存在,应用 SPSS数据处理系统对正交试验数据进行方差分析,找出起主导作用的变异来源,正交试验的方差分析结果见表4.从表 3可以看出,影响 FPA的因素为:A＞D＞C＞B,即培养温度＞稻草粉与麸皮比＞NH4 NO3＞吐温80.统计分析和显著性测验结果（表4）表明,因素A（温度）、C（NH4 NO3）和 D（稻草粉与麸皮比）对 FPA的影响极显著,因素 B（吐温 80）对 FPA的影响不显著.对于因素 A、C和 D,通过比较 K值的大小,确定最优水平分别为 A1、C2、D1;对于因素 B,水平改变对试验结果几乎不影响,从实际生产成本考虑,应选择 B1.本试验确定的最优水平组合为 A1 B1 C2 D1,即培养温度28℃、吐温80含量 0.1%、NH4 NO3含氮量 0.4%、稻草粉与麸皮比5∶0时.此条件下的FPA为6.125 IU◦g-1.通过对主要营养因子与环境条件的优化,初步确定了哈茨木霉 APS62菌株产酶最佳培养基组成为:NH4 NO3（总氮量 0.4%）、5 g稻草粉、0 g麸皮、15 mL营养盐、0.1%吐温 80.适宜的发酵工艺条件:培养基起始 pH为 5.0,培养温度为28℃,接种量为 6%,培养时间 3 d.本试验结果表明,APS62菌株产纤维素酶的最适接种量为 6%,与徐昶等[7]的研究结果一致;而吴昊[9]的研究结果表明,霉菌产酶的最适接种量为 10%.这可能是因为虽同属霉菌,但不同菌种的性状之间存在很大的差异.研究表明,添加适量麸皮对菌株生长和产酶均有促进作用[7,9],而本试验结果表明,添加麸皮后,菌株FPA反而下降.可能是由于 APS62菌株在利用碳源时,首先利用麸皮中的淀粉类,而后才利用稻草中纤维素的缘故.【相关文献】[1]刘颖,张玮玮,王馥.绿色木霉产纤维素酶发酵条件的研究[J].食品工业科技,2008,29（3）:128-130.[2]王颖.纤维素酶产生菌的筛选[J].牡丹江医学院学报,2009,30（4）:90-92.[3]唐德芳,裴小琼,李晓璐.黑曲霉β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及表达[J].应用与环境生物学报,2009,15（3）:423-426.[4]王春丽,武改红,陈畅,等.黑曲霉原生质体诱变选育β-葡萄糖苷酶高产菌株[J].生物工程学报,2009,25（12）:1921-1926.[5]冀春雪,杜风光,史吉平,等.纤维乙醇用纤维素酶的研究进展[J].酿酒科技,2007（7）:118-121.[6]张德强,黄镇亚,张志毅.木质纤维生物量一步法（SSF）转化成乙醇的研究进展[J].北京林业大学学报,2001,23（6）:52-55.[7]徐昶,龙敏南,邬小兵,等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2005,44（1）:107-111.[8]GHOSE T K.Measurementof cellu lase activities[J].Pure Appl Chem,1987,59（2）:257-268.[9]吴昊.纤维素酶高产菌株的选育[D].南京:南京理工大学,2004.。
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
14
1.1.3 试剂 1mg/mL 葡萄糖标准液: 葡萄糖置于 110℃烘箱
中烘 2h 至恒重，称取 0.1g 烘好的葡萄糖，溶解并定 容至 100mL。
0.01M 乙酸-乙酸钠缓冲溶液 (pH4.8):A 液：冰 醋酸 6mL，蒸馏水定容至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸 溶 液 ；B 液 ： 称 取 8.2g 醋 酸 钠 ， 蒸 馏 水 定 容 至 1000mL，配制成 0.1M 醋酸钠溶液；以 A：B=4：6 的比 例混合，低温冷藏备用。
5g 固 体 曲 湿 料 加 50mL 去 离 子 水 ，30℃ 浸 提 6min，纱 布 过 滤 ，3000r/min 15min，上 清 液 即 为 用 于 测定的固体曲酶液。 1.2.4.2 DNS 法测定波长的确定
取 0.5mL 葡萄糖标准液及 0.5mL 蒸馏水分别置 于 25mL 试 管 中 ，再 各 加 2mL DNS 试 剂 ，沸 水 浴 加 热 5min，流水冷却，蒸馏水定容至 25mL。 将 DNS 试 剂-水(空白)、葡萄糖显色液-DNS 试剂(空白)分别在 波长 400nm～600nm 范围内进行扫描。 1.2.4.3 葡萄糖标准曲线的绘制
第 46 卷（总第 155 期）
Food and Fermentation Technology
第 46 卷（第 1 期） Vol.46，No.1
高产纤维素酶生产菌的筛选及诱变育种
方尚玲，杨丹丹，钱志伟，李小强，陈茂彬*
（发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北工业大学生物工程学院，湖北武汉 430068）
取 8 支洗净烘干的 25mL 比色管，编号后按表 1 加入标准葡萄糖溶液和蒸馏水， 配制成一系列不同 浓度的葡萄糖溶液。 充分摇匀后， 向各试管中加入 2mLDNS 溶液,沸水浴 5min，取出冷却后用蒸馏水定 容至 25mL，充分混匀。 在选定波长下，以 1 号试管溶 液作为空白对照， 测定其它各管溶液的 OD 值并记 录结果。 以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的 OD 值为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线。 1.2.4.4 内切纤维素酶活[8](Cx，CMC 酶活)
原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
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同
产纤维素酶菌株原生质体制备及再 生条件
李 淼， 曾柏全 ， 冯金儒
（ 中南林 业科技 大学 生命科 学与技术 学院 ，湖 南 长 沙 ４ １ ０ ０ ０ ４ ）
摘 要：研究青霉菌 Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ 和枯草 芽孢 杆菌 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ Ｋ ３原生质体制备与再 生的最佳条件 。采用 酶解法制备 了青 霉菌和枯草芽孢杆菌 的高质量 的原 生质 体。试验对亲本菌株 的菌丝生长，酶浓度 ，酶解 时间和 灭活时 间进行 了优化 。亲 本菌 株 Ｏ ５ ，培养液 中加入浓度 ０ ． ５ ％ 甘氨酸和含量 １ ０ ％ 的蔗糖 处理后 ，在质量 浓度 均
Ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ ａ ｎ ｄ
Ｂａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ｋ ３
率 与 再 生 率 的乘 积 达 到最 大值 ，此 时 Ｋ３原 生 质 体 量 为 １ ． ４ ６ ×１ ０ ｃ ｆ ｕ ／ ｍＬ 。青霉菌在 ６ ５℃ 热 灭 活 的 时 间 为 ｌ ｈ ，
紫外灭活时间为 ３ ｍｉ ｎ ；枯草芽孢杆菌在 ６ ５ ℃热灭活的时间是 ２ ． ５ ｈ ，紫外灭活时间为 ５ ｍｉ ｎ 。这为后续原生质 体 融合选 育具有抗逆性 的高产纤维素酶菌株打下基础。
ＬＩ Ｍｉ ａ ｏ ， ＺＥＮＧ Ｂａ ｉ — ｑ ｕ ａ ｎ ， Ｆ ＥＮＧ Ｊ ｉ ｎ — ｒ ｕ
（ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｌ ｉ ￣ｏ ｆ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄＴ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｌ Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ ａ ｎ ｄＴ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ４ １ ０ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍｕ ｍ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｒ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｄ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ ａ ｎ ｄ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ
为 １ ０ ｍｇ ／ ｍＬ的 溶 菌 酶 和 蜗 牛 酶 （ １ ：１ ） 酶解 作 用 下 ， ３ ５ ℃处理 ３ ｈ ，原 生 质 体 生 成 量 达 到 最 大 值 ，为 ７ ． ３ ５ ×１ ０ 。
ｃ ｆ ｕ ／ ｍＬ；亲本菌株 Ｋ ３ ，用 ４ Ｕ ／ ｍＬ的青霉 素处理，在 １ ｍｇ ／ ｍＬ的溶菌酶作用 下，３ ５℃处理 １ ｈ ，原生质体形成
关 键 词 ：青 霉 菌 Ｏ５ ； 枯 草 芽 孢杆 菌 Ｋ３ ； 原 生质 体 制 备 ；原 生 质 体 再 生 ； 原 生 质 体 灭活
中图分类号：￥ ７ １ ８ ． ８
文献标志码：Ａ
文章编号：１ ６ ７ ３ — ９ ２ ３ Ｘ（ ２ ０ １ ３ ） １ ２ 一 ｏ ｌ ７ ４ — ０ ７
ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ Ｋ３ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｔ ｕ ｄ ｉ ｅ ｄ ． Ｔ ｈ ｅ ｈ ｉ ｇ ｈ — ｑ ｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ｐ ｒ ｏ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｔ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ Ｑ５ ａ ｎ ｄ Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ Ｋ３ ｈ ａ ｖ ｅ ｂ ｅ ｅ ｎ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍａ ｔ ｉ ｃ
第 ３ ３卷 第 １ ２期 ２ ０ １ ３ 年 １ ２月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎａ ｌ ｏ ｆ Ｃｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｌ Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｆｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ＆ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
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