1班3组微生物自主实验论文—高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测

高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测

一班3组

摘要：本组实验通过从土壤中取样并经过选择培养和梯度稀释，将所得样品进行纯化培养

后染色鉴别，之后挑取菌落进行涂布培养，即可分离出高产纤维素酶菌株。为确定分离得到

的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，我组采用液体发酵法。我组培养基在

培养过程中有菌落生长，后来观察到产生透明圈的菌落，经过分离纯化，进一步筛选出了单

菌落，然后又进行了镜检，最后通过液体发酵，检验了纤维素酶的活性。

关键词：高产纤维素酶菌株、分离、酶活性检测

1.研究方法：

1.1实验材料及用具

土壤、滤纸、刚果红染料、试管、培养皿、玻璃棒、烧杯、酒精灯、称量纸、天平、揺瓶、

摇床、胶头滴管、接种环、接种针、酒精棉球、无菌操作台、离心管、高速离心机、牛津杯

培养基、鉴别培养基、液体发酵法所需培养基

1.2实验方法

1.2.1高产纤维素酶菌株的分离

(1)土壤取样：在富含纤维素的环境中土壤取样，比如取树林中多年落叶形成的腐殖土。

(2)制备选择培养基：

纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 溶解后，

蒸馏水定容至1000mL

(3)制备鉴别培养基：

纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 琼脂

20g 刚果红 0.2g 溶解后，蒸馏水定容至1000mL

(4)选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于

摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5 mL），转

移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。

(5)梯度稀释：按照前面的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释10～1000000

倍。

(6)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：制备鉴别培养基后涂布平板，将稀释度为

104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。

(7)纯化培养：在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，

在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。

1.2.2纤维素酶活力鉴定

(1)发酵培养：取上鉴别培养基长出的单菌落，在无菌环境中将菌株接种到液体培养基中，

然后摇床发酵培养24h。

(2)纤维素酶液获取：取发酵液2ml加入离心管，共加4支，高速离心5min后取出，上清液

即为欲获取的酶液。

(3)酶活性检测：将所取酶液加入到插有牛津杯的鉴别培养基中的牛津杯中，然后30度左右，

放置24h，观察透明圈大小，透明圈越大，说明酶活力越高。

2.结果

培养基在培养过程中有菌落生长

观察到产生透明圈的菌落

镜检结果

菌

革

兰

氏

阳

性

杆

菌

酶活性检验的结果

革

兰

氏

阴

性

杆

菌

革

兰

氏

阴

性

球

菌菌

三个透明圈从左到右依次为：革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性球菌

经测量透明圈直径大小分别为为0.81cm、0.65cm、0.74cm，说明我们组所获得的三种菌种革兰氏阳性杆菌的酶活性最高，革兰氏阴性杆菌酶活性最低，因此革兰氏阳性杆菌较为高产3.讨论

（1）土壤取样：由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，比如树林中多年落叶形成的腐殖土，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

（2）选择培养：目的是为了增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

另外，分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。

（3）我组培养基在培养过程中有菌落生长，同时我们所设置的未菌的对照培养基无菌落产生说明培养基制作合格。

（4）观察到产生透明圈的菌落，则说明获得了分解纤维素的微生物。

（5）纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解纤维素分解菌鉴别培养基所产生的透明圈大小进行定量测定。

（6）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

4.结论

本次实验成功分离出高产纤维素酶菌株并进行了酶活性检测，检测结果表明我组所分离的几种菌种，革兰氏阳性杆菌较为高产

参考文献：