蛋白质羰基化反应及其对肉制品的影响

蛋白质羰基化反应及其对肉制品的影响摘要：蛋白质羰基化反应遍是蛋白氧化中最显著的化学修饰之一，受到研究人员的高度重视。

研究表明蛋白羰基对肉制品品质特征如结构、功能、营养价值有一定的影响。

本研究对肉和肉制品中羰基含量的变化、蛋白羰基的形成机理及对蛋白品质的影响等进行综述。

关键词：蛋白质羰基，结构，品质蛋白质氧化是一种复杂的现象，蛋白质种类和氧化条件决定了蛋白质氧化途径和氧化产物的性质[1]。

活性氧（ROS）、过渡金属、脂质氧化等都能引发蛋白质的氧化损伤。

氨基酸侧链以及多肽骨架的变化会使蛋白质的理化性质发生改变，包括多肽骨架断裂、蛋白聚合、溶解度降低、功能性质丧失和蛋白质水解敏感性降低等[2]。

在肉体系中，一般采用多种化学修饰评价蛋白质氧化，包括硫醇基损失[3]、色氨酸荧光强度降低[4]、羰基衍生物形成[5]和蛋白质内部及蛋白质之间的交联的形成[6]。

在以上氧化评价中，蛋白羰基化合物的形成被认为是氧化蛋白最为显著的变化[7]。

2,4-二硝基苯肼法测羰基含量已成为评价肉和生物体系中蛋白氧化的常用方法[8]。

虽然蛋白羰基值是评价蛋白氧化的一项重要指标，但是它在食物体系中的实际影响还并不清楚。

蛋白氧化对肉制品的影响一直是各种研究的热点，蛋白氧化会影响肌肉蛋白酶活性和蛋白质的功能这一观点已被广泛接受[7]，研究证明氧化反应也会改变肌肉蛋白消化率、持水性以及宰后肉的嫩度[9]，但目前关于蛋白羰基化反应如何诱导改变蛋白质理化性质的作用机理仍不清楚。

明确特殊羰基的形成途径和机制有助于进一步理解羰基化合物对蛋白质品质的影响。

Estévez等[10]采用液相色谱-电喷雾-质谱法(LC–ESI–MS) 已鉴定出氧化的肌原纤维蛋白中特殊蛋白羰基，即α-氨基脂肪半醛（AAS）和γ-谷氨酸半醛（GGS）。

在研究过渡金属和酚类物质对肌原纤维蛋白羰基化反应的影响、在Strecker型反应中半醛与未氧化氨基酸的反应变化、蛋白质羰基与持水性降低之间的潜在联系等方面，采用这种精确检测方法取得一定的研究进展[4,11]。

相较其它食品成分研究领域的发展高度（如脂质氧化），关于蛋白质氧化的基本知识较少。

产生这种情况的原因包括：食物蛋白氧化的化学变化的高度复杂性；缺乏评价食物蛋白氧化的特定方法；认为脂质氧化和微生物腐败等生物化学现象足以解释食物体系中所有的有害变化。

本文以蛋白羰基作为肉制品的氧化损伤的一种指标，对蛋白羰基的形成机理，加工储藏过程中羰基含量的变化以及以蛋白羰基化反应对肉制品的影响进行综述。

1蛋白羰基1.1蛋白羰基的形成羰基化反应是蛋白质发生的一种不可逆非酶修饰，其中氧化应激和其它机制也能诱导羰基分子的形成[12]。

蛋白质中羰基化合物（醛和酮）形成主要是通过以下四个途径：(1)赖氨酸，苏氨酸，精氨酸和脯氨酸侧链的直接氧化[13]；(2)在还原糖的作用下发生非酶糖化反应[14]；(3)通过α-酰胺化途径或在谷酰基侧链氧化情况下多肽链的氧化断裂[12]；(4)与非蛋白羰基如4-羟基-2-壬醛(HNE)或丙二醛（MDA）共价结合[15] (图1)。

在以上四个形成途径中，氨基酸侧链氧化是蛋白羰基形成的主要途径，也是直接氧化攻击蛋白的最有效和主要途径[16]，并且这也是唯一已被证实的肉蛋白中羰基形成的机制[11]。

Park 等[17]研究体外肌原纤维蛋白的氧化情况时，多肽链断裂对羰基形成几乎没有影响。

其它三种机制可能在复杂食物体系中适用，但是这些机制对肉蛋白羰基化反应的相关作用仍然不清楚。

（1）H 2NNH 2HO H 2NH 2O O 2 赖氨酸 α-氨基脂肪半醛（2）O OH RH 3N NH 2H O H 3N NH 2H O NH3＋O R O O NH 2 葡萄糖 赖氨酸 α-氨基脂肪半醛（3） NH NH NHNH O O R 2R 1O O R 3Peptide NH NH 2R 1O O PeptideNH NH O R 2O R 3O Peptide Peptide 多肽（4）NH R 1OO NHPeptideOH O NH 2R 1O Peptide H 3C NH O O Peptide OHHO O O ·2谷酰基多肽（5）C 2C O O HH C 2CH N NH 2O O H 2N NH 2O 丙二醛(MDA) 赖氨酸（6）H 2N NH 2OH 3C n H 3C OH On 3COH O 2O 多不饱和脂肪酸（PUFA ） 4-羟基-2-壬醛(HNE) 赖氨酸图1蛋白质羰基的形成机理赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和脯氨酸侧链的羰基衍生物的形成是金属离子催化氧化(MCO)的结果[18]。

根据这种机制，在敏感氨基酸侧链近处，Fenton 反应中还原态的过渡金属离子将H 2O 2还原为反应中间体（羟自由基；•OH ）（图1，反应1）。

根据位点特异性机制，蛋白质中金属结合位点的存在说明了这些位点上的氨基酸残基对MCO 具有专一性[18]。

但一些研究人员认为在温和氧化条件下，MCO 易受蛋白的金属结合位点限制，因为几乎所有氨基酸残基都易在高度氧化条件（高浓度的H2O2和金属离子）下发生氧化。

过度金属离子的氧化态形式如Fe3+在类似Fenton反应中使H2O2生成HO2•自由基(反应2)。

大量科学研究表明，在ROS介导反应中还原态和氧化态金属离子（如Fe2+和Fe3+）能够促进蛋白羰基形成[19]。

事实上，特定金属离子的两种氧化状态如铁（Fe2+/ Fe3+）和铜（Cu+/ Cu2+）在生物体系中同时存在，它们作为电子供体（还原态）或受体（氧化态）。

氧化还原循环赋予了重要的催化性能，包括分子氧还原成超氧阴离子自由基（反应3），经过连续反应形成过氧化氢（反应4）和羟自由基（反应5）和脂肪氢过氧化物（LOOH）裂解后形成过氧化氢和烷氧自由基（反应6和7）。

M n+ +H2O2 M(n+1)+ + HO- + HO·(1) Fe3+ + H2O2 Fe2+ + HO2•+ H+(2) M n+ +O2 M(n+1)+ + O2•-•(3) 2O2•- +2H+H2O2+ O2 (4) O2•- + H2O2 O2 + HO- + HO·(5) M n+ + LOOH M(n+1)+ + LO·+ HO-(6) M(n+1)+ + LOOH M n+ + LOO·+ H+(7) MCO的结果是苏氨酸氧化为α-氨基-3-酮基丁酸，赖氨酸氧化为α-氨基脂肪半醛（AAS）和精氨酸和脯氨酸氧化为γ-谷氨酸半醛（GGS）。

AA和GGS都作为金属介导的蛋白氧化的主要羰基产物，在血浆和猪肝中这两种半醛占总羰基含量的23%~60% [19]。

活性物质攻击氨基酸侧链上的氨基，从相邻碳原子上夺取一个氢原子，形成了以碳为中心的蛋白自由基。

在进一步反应中，氧化态的金属离子接受碳自由基的孤电子形成亚氨基，自发水解生成相应的醛分子[19]。

2在加工和储藏过程中肉和肉制品中蛋白羰基变化2.1肉成熟过程中蛋白羰基的变化ROS的形成是需氧型新陈代谢的必然后果，因此生物体内脂肪和蛋白一定会发生氧化反应。

大多数人和动物组织体内总羰基含量约在1-2 nmol/mg 蛋白，这表明约10%的总细胞蛋白表现出氧化修饰[20]。

动物宰杀后，在肌肉成熟过程中发生了生物化学变化，其内源抗氧化机制部分破坏，促进了蛋白氧化的发生。

牛肉肌原纤维蛋白在0°C下储存，随着肌肉pH值下降，蛋白羰基含量显著增加[21]。

研究表明高浓度的氢离子促进了肌红蛋白的氧化还原循环，因此氢离子有促氧化作用。

肌肉pH值降低易使蛋白发生聚合、变性、溶解性降低，进一步影响蛋白氧化的敏感性。

根据最近研究，宰前应激使肉鸡胸肉的pH值变低，促使蛋白羰基形成，蛋白发生变性和溶解性降低[22]。

但Chan等[23]的研究表明，火鸡宰后24h 时肌肉pH值对蛋白羰基化程度无影响。

研究人员研究表明：pH值对蛋白羰基化反应有一定的影响，且主要归结于火鸡肌肉比肉鸡肌肉有更好的抗氧化保护系统。

除pH值下降之外，肉宰后其它生物化学变化例如具有催化性的游离态金属离子和氧化酶的释放以及脂肪氧化反应的诱导作用很有可能促进宰后僵尸肉中蛋白羰基的形成。

2.2冷藏和冻藏过程中蛋白羰基的变化Martinaud等[3]首次描述牛宰后肌肉中出现的蛋白氧化现象。

牛腰最长肌和膈膜肌经过10天冷藏后，其总蛋白羰基含量增加分别从3.1到5.1 nmol/mg 蛋白，4.8到6.9 nmol/mg 蛋白。

随后大量研究证实了成熟或冷藏过程中猪肉、家禽、鸵鸟肉、火鸡肉等蛋白羰基化反应的出现。

不同学者采用相同的技术(DNPH法)测定相近肉体系中总蛋白羰基含量，得到结果差异较大，不利于归纳蛋白羰基形成的一般规律，冷藏初期的牛肌肉中蛋白羰基含量达到3.1–4.8 nmol/mg蛋白，但是在高氧状态下冷藏6天的牛肉馅饼中羰基含量只有1.9 nmol/mg 蛋白[3,24]；常压冷藏9天的火鸡肌肉蛋白羰基含量比高浓度氧下冷藏14天的猪肉的蛋白羰基含量更高,分别是3.1–3.4 nmol/mg 蛋白和1.1 nmol/mg 蛋白[5,25]；鲜猪腰和先盐渍后经3个月成熟的干熏猪腰的蛋白羰基含量相似[25,26]。

总而言之，蛋白羰基化程度取决于肉的种类，肌肉类型和储存条件。

研究表明牛肉比猪肉更容易发生蛋白羰基化反应，主要是牛肌肉中有较多的铁离子和肌红蛋白[25]。

同样地，氧化和糖酵解的肌肉对蛋白羰基反应的敏感性差异也取决于肌肉组成成分[27]。

研究表明肌肉在冻藏条件下蛋白仍会发生羰基化反应。

例如，Soyer等[28]研究不同冻藏温度（-7℃、-12℃和-18℃）和冻藏时间对肌肉蛋白氧化的影响。

肌肉在冻藏6个月过程中羰基含量显著增长，前3个月各储藏温度下蛋白羰基含量无显著差异，后3个月各处理组间蛋白羰基含量呈显著差异，其中-7℃条件下蛋白羰基增长最显著。

猪背最长肌经过不同（0,1,3,5次）冷冻/解冻循环，最终发现5次冷冻/解冻后蛋白羰基含量增加显著（从1.09到1,16nmol/mg 蛋白质），这主要是因为反复冷冻/解冻导致细胞破坏，其中的氧化酶和促氧化剂的释放促进羰基的形成[29]。

猪背最长肌和腰大肌在-18℃冻藏2个月后，AAS和GGS含量显著升高，后2个月后含量显著降低，此结果表明在冻藏过程中这两种蛋白羰基会发生进一步的反应生成其它物质[30]。

蛋白羰基化反应与脂肪氧化反应密切相关，也有肌肉类型[30]、冷冻温度[28]、包装条件以及预处理如预先切碎[30]有关。

2.3加工过程中蛋白羰基变化许多加工技术如辐照、烹饪、发酵、高静压等都促进蛋白发生羰基化反应。