蛋白酶酶活测定方法及原理简介

蛋白酶酶活测定方法及原理Protease activity assay method and principle 方法原理福林酚法福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。

考马斯亮蓝法考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

甲醛滴定法蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。

DHT-酪蛋白法用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。

以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。

选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。

DNA-溴乙锭荧光分析法溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。

接近饱和的溴乙锭(0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。

在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。

通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。

X-光胶片法酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。

蛋白酶活性的测定方法

蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。

测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。

2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。

荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。

3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。

通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。

4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。

5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。

需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。

实验六胰蛋白酶活力的测定

稀释后Ty（μg/ml） 0
20
40
60
80
100
Na2CO3(ml) 酚试剂(ml)
A680nm
5
5
5
5
5
5
1
1
1
1
1
1
迅速混合，于40℃放置15分钟
调0
以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。
2、蛋白酶活力的测定
管号
1号(样品) 2号(对照)
酶液（ml）
1
A 样：样品液光吸收值； A 对：对照液光吸收值； K ：标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（分），本实验 t =10 ； V ：酶促反应管的总体积（毫升数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:2000
五、思考题
酶的试验为何设对照又要设空白稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原
因。如何保证本实验测定数据的准确性？
2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物,680nm）
3．用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。
4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3

蛋白酶酶活测定方法

蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。

本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。

在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。

一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。

二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。

底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。

三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。

四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。

蛋白酶活性测定

1.5.2.2 蛋白酶活性测定采用福林酚−试剂法[3]测定肠道及肝胰脏中蛋白酶活性，其原理是：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯醋酸（TCA ）氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，这些氨基酸可与福林酚试剂反应呈蓝色，用756分光光度计在波长680nm 测定。

蛋白酶活性的定义：1克食糜或组织在30℃，pH7.0[4]的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg 酪氨酸的酶量为1个蛋白酶活力单位。

测定步骤如下：将2%的酪蛋白溶液放入30℃恒温水浴锅中预热3-5min ，每个样品取两个重复（每个酶液样品设一个空白对照），各取1mL 酶液注入试管中，在30℃恒温水浴锅中预热1-2min ，加入2%的酪蛋白1mL ，准确反应10min ，加0.4M 三氯醋酸2mL 终止反应，在水浴锅中静置10min 后过滤，取滤液0.5mL 加0.4M 碳酸钠溶液2.5mL ，并加入显色剂福林试剂0.5mL 摇匀，在30℃恒温水浴中显色20min ，取出放在756分光光度计，680nm 的波长下测定吸光度（OD ）。

蛋白酶活性计算公式：4—反应总体积(mL) 10—反应时间(min) K —标准曲线获取 N —酶液稀释倍数 M —样品质量(g)A. Setting up the Protease Assay1. Pre-heat 0.5% Casein solution In a water-bath at 30 o C for 5min2. Follow the following table蛋白酶酶活性(U/g) =4×K×OD×N 10×M3.4.Follow the following table to determine sample blank。

蛋白酶活力的测定

1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。

福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。

因此可利用此原理测定蛋白酶活力。

通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。

此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。

1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。

简述蛋白酶活力测定的原理

简述蛋白酶活力测定的原理蛋白酶活力测定是一种用于评估酶分解蛋白质的能力的方法。

蛋白质是生命活动不可或缺的重要分子，然而，它们需要在体内被分解为较小的分子才能被利用。

其中，蛋白酶是一种特殊的酶，它能够将蛋白质分解为较小的肽链或氨基酸。

蛋白酶活力测定的原理主要基于蛋白质分解后的产物——氨基酸的检测。

在这个测定中，蛋白质被蛋白酶分解为氨基酸，然后这些氨基酸与一些特定的化学物质反应，产生一种有颜色的产物，这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。

通过测量溶液的吸光度，可以定量地测定蛋白酶的活力。

具体来说，测定蛋白酶活力的步骤如下：1.准备测试样品：将待测的蛋白酶与适当底物（即待分解的蛋白质）混合，置于适宜的反应条件下。

2.设定反应时间：在一定时间内，蛋白酶将底物分解为氨基酸。

为了确保反应在最佳条件下进行，需要设定一个适当的反应时间。

3.终止反应：在反应达到设定时间后，需要终止酶促反应，以便停止蛋白质的分解。

通常使用一种称为终止液的化学物质来实现这一步骤。

4.显色反应：终止液中的化学物质将与氨基酸反应，生成一种有颜色的产物。

这种产物能够吸收光，从而使溶液的吸光度增加。

5.吸光度测量：使用分光光度计测量溶液的吸光度。

吸光度的大小与溶液中氨基酸的浓度成正比，因此可以用来计算蛋白酶的活力。

通过这种测定方法，可以评估不同样品中蛋白酶的相对活力，并了解在不同条件下的酶促反应动力学。

这对于研究蛋白质分解过程、优化蛋白质分解反应的条件以及生物工程等领域都具有重要意义。

此外，蛋白酶活力测定也可以用于诊断和治疗某些与蛋白质分解相关的疾病，如胰腺炎等。

总之，蛋白酶活力测定的原理是基于蛋白质分解后的氨基酸形成染料，通过测量溶液的吸光度来定量测定蛋白酶活力。

这种方法在生物学、生物工程和医学等领域具有广泛的应用价值。

蛋白酶活性测定方法

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

实验四蛋白酶活力的测定

实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。

2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。

4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。

将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

三支试管中反应液用滤纸过滤。

另取三支试管（一支空白。

两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。

5.数据处理。

蛋白酶活性检验方法

蛋白酶活性检验方法1 定义1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

蛋白酶活性的测定方法

结果分析
酶活性计算
根据实验数据，计算蛋白酶的活性，包括比活力和米氏常数等参数。
显著性检验
通过t检验、方差分析等方法，对实验组和对照组之间的差异进行显著性检验，确定实验结果是否具有统计学意义。
可重复性评估
评估实验结果的重复性，判断实验方法的可靠性和稳定性。
误差分析
误差来源
分析实验过程中可能存在的误差来源，如试剂不纯、操作误差、仪器误差等。
电化学法
总结词
电化学法是一种快速、简便的蛋白酶活性测定方法，通过电化学信号的变化来检测酶的活性。
详细描述
电化学法利用电化学探针或电极检测酶反应过程中产生的电化学信号，如电流、电位等，通过分析这些信号的变化可以计算酶的活性。该方法具有快速、简便和实时监测等优点。
核磁共振法
总结词
核磁共振法是一种高分辨率、高灵敏度的蛋白酶活性测定方法，通过检测核自旋磁矩的变化来计算酶的活性。
酶液的保存
选择适当的保存条件，如温度、pH值和添加稳定剂等，以确保酶液的活性。
反应条件优化
温度对酶活性的影响
通过在不同温度下测定酶活性，找到最适温度范围，确保酶活性的最大化。
pH对酶活性的影响
在不同pH条件下测定酶活性，找到最适pH值，确保酶活性的最大化。
底物浓度对酶活性的影响
通过改变底物浓度，观察酶活性的变化，找到最佳底物浓度。
在测定过程中，可能存在异常值、缺失值或重复数据，需要进行数据清洗，确保数据准确性和可靠性。
图表绘制
通过绘制图表，如柱状图、折线图或散点图，可以直观地展示蛋白酶活性随时间、温度、pH 等参数的变化趋势。
数据转换
根据需要，对数据进行适当的数学转换，如对数转换或归一化处理，以便更好地分析数据。

蛋白酶酶活力的测定

五。结果及分析
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社

蛋白酶的检测方法

解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展1 定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/ mL)表示。

2 福林法(第一法)2、1 原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液2、2、1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。

混匀，过滤。

制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c(CCl3·COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c(HCI)=1 mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

蛋白酶活力的测定

实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。

2、深入了解酶的活力和比活力的概念。

二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。

2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。

3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。

4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。

5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。

三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。

（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。

（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。

以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。

管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定（1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。

将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。

蛋白酶检测操作

蛋白酶检测操作1. 概述蛋白酶检测是一种用于检测样品中蛋白酶活性和浓度的实验操作。

蛋白酶是一类能够降解蛋白质的酶，其活性和浓度的检测对于许多生物学和生化学研究非常重要。

本文将介绍蛋白酶检测的基本原理、常用的实验方法和操作步骤，并简要介绍一些常见的蛋白酶检测试剂和设备。

2. 基本原理蛋白酶检测的基本原理是通过特定的底物或试剂与蛋白酶发生反应来间接或直接测定蛋白酶的活性或浓度。

常用的蛋白酶检测方法包括颜色反应法、荧光法和质谱法等。

2.1 颜色反应法颜色反应法是一种常用的蛋白酶活性测定方法，其原理是将蛋白酶作用于特定的底物后，产生的产物与某些指示剂发生颜色变化，并通过测定颜色的强度来间接测定蛋白酶的活性。

常用的颜色反应法有Bradford法、Lowry法和BCA法等。

这些方法的原理相似，底物与蛋白酶作用后产生巯基体系或受酸水解而形成可着色反应产物，其颜色强度与酶活性成正比。

2.2 荧光法荧光法是一种直接测定蛋白酶活性的方法，其原理是利用荧光探针与蛋白酶反应后荧光强度的变化来测定酶活性。

荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测的优点。

常用的荧光法有AF488-Casein法和AF488-Gelatin法等。

这些方法的原理是荧光探针与蛋白酶结合后产生荧光信号，可以通过荧光显微镜或荧光光度计进行测定。

2.3 质谱法质谱法是一种直接测定蛋白酶活性和浓度的方法，其原理是利用质谱仪对蛋白酶水解产物进行检测和定量分析。

质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优点。

常用的质谱法有MALDI-TOF法和LC-MS法等。

这些方法的原理是将蛋白酶水解产物通过质谱仪分析和测定，可以得到酶活性和浓度的相关信息。

3. 实验方法和操作步骤3.1 颜色反应法3.1.1 Bradford法材料准备•Bradford试剂•蛋白质标准溶液•待测样品实验步骤1.准备一系列不同浓度的蛋白质标准溶液，浓度范围覆盖待测样品的浓度。

2.取一定量的标准溶液和样品，分别加入试管中。

木瓜蛋白酶酶活力测定

木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。

2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。

3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。

4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。

4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。

在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。

临用现配。

4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。

4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。

4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。

实验4蛋白酶提取及其酶活的测定

实验4 蛋白酶提取及其酶活的测定一、实验目的1. 了解毛霉蛋白酶的特性和提取方法。

2. 掌握蛋白酶酶活测定的原理和方法。

二、实验原理毛霉蛋白酶是一种水溶性水解酶，可以用水或盐水直接抽提，也可以用缓冲液进行提取，从而得到其粗酶制剂。

蛋白酶具有水解蛋白质的能力，本实验采用酪蛋白为底物进行酶活的测定。

酶活定义为：在40℃，适宜pH（如pH7.0～7.5）条件下，1 min内水解酪蛋白产生1ug酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位。

酪氨酸的测定按下面的方法进行。

取适当稀释的粗酶液，先跟酪蛋白溶液混合，于40℃下酶解，然后加三氯醋酸（TCA）溶液终止反应并沉淀蛋白，离心取滤液（含水解产生的酪氨酸）加福林酚工作液（黄色）进行显色反应（在碱性条件下，磷钼酸与磷钨酸混合物可被酚类化合物还原而呈蓝色），然后在680nm处测定吸光度即可知道酪氨酸的浓度，从而推算出蛋白酶的活力。

三、实验试剂与仪器1. 材料毛霉固体发酵培养物（由前实验得到）。

2. 试剂2%酪蛋白溶液、0.4mol/L TCA、0.4 mol/L Na2CO3、0.3mol/LNaCl、福林酚工作液、pH7.2磷酸缓冲液等。

3. 仪器：水浴锅、722型分光光度计、试管、吸管、抽滤装置、离心机等。

四、实验步骤1. 粗酶制剂的制备取1瓶固体培养物加50mL的0.3mol/LNaCl溶液摇匀，于40℃水浴保温浸提1 h，然后抽滤，滤渣加不超过50mL体积的0.3mol/LNaCl溶液，重复提取一次，合并两次滤液定容到100mL，备用。

2. 酶促反应取酶液样品用蒸馏水作适当稀释后，按下表进行操作。

* 净E值＝样品平均E值－空白E值。

3. 酶活力计算在上述条件下，将每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为一个蛋白酶活力单位。

蛋白酶活力＝（A/10）×4×N式中A——由样品测得的净E值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数。

10——反应时间10 min。

蛋白酶活性的测定

实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。

二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。

酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。

在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。

三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。

0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。

０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。

2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。

５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。

四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。

２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。

在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。

00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。

00ml５％三氯醋酸溶液。

4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。

5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。

蛋白酶的测定及其原理

蛋白酶的测定及其原理
蛋白酶是一类能够催化蛋白质分解的酶。

它们广泛存在于生物体内，是许多代谢和消化过程中至关重要的催化剂。

蛋白酶的测定可以用于研究其功能和活性，以及诊断和治疗相关疾病。

蛋白酶的测定方法很多，其中一些常用的方法包括：
1. 酶活法：通过添加底物和检测产物量的变化来确定酶的活性。

比如，可以测定蛋白酶在一定条件下能够分解的特定蛋白质量，从而得出其活性。

2. 基质-胶体法：利用与酶具有亲和性的果胶等高分子基质，将其与染色剂混合形成胶体，然后加入酶并在一定时间内观察胶体溶解的程度来确定酶的活性。

3. 蛋白质凝胶法：利用酶能够水解凝胶，从而观察凝胶溶解的程度来测定酶的活性。

蛋白酶测定的原理主要是根据酶与底物之间的相互作用以及酶催化反应的特性来进行的。

一般来说，酶与底物之间会发生一系列化学反应，通过添加某些试剂或观察特定的指标来检测这些反应，从而确定酶的活性。

具体原理和方法可以根据不同的测定技术而有所差异。