食品中还原型抗坏血酸的测定
食品营养与卫生选做实验食品中总抗坏血酸测定
选做实验食品中总抗坏血酸测定（荧光法）（一）目的意义食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。
当食物放置时间较长或经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸仍有85％左右的维生紊C活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。
（二）原理样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。
脱氢型抗坏血酸与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。
（三）仪器与试剂1. 荧光分光光度计或有338nm及340nm波长的荧光计2. 捣碎机3. 100ml容量瓶，锥形瓶，具塞试管。
4. 偏磷酸一乙酸液称取30g偏磷酸（HPO3），溶于80ml冰乙酸中，加500ml 蒸馏水混匀，稀释至1000ml。
于4℃冰箱可保存7～10天。
5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液制法同4，只是用0.18mol／L硫酸代替蒸馏水。
6．醋酸钠溶液溶解500g醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至1000ml。
7. 硼酸一醋酸钠溶液溶解3g硼酸于100ml醋酸钠溶液中，临用前配制。
8. 邻苯二胺溶液称取20mg邻苯二胺，于临用前溶解至100ml。
9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液称取0.lg百里酚蓝，加0.02mol／L氢氧化钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是10.75ml，研磨溶解后的溶液用水稀释至250ml。
10．活性炭的活化加200g碳粉与lL盐酸浓溶液（1份盐酸＋9份水），加热回流1～2小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。
11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml）精确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸—乙酸液溶解至50ml容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）。
12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml）取10ml抗坏血酸标准液用偏磷酸—乙酸液稀释至100ml。
实习四 食品中总抗坏血酸测定
实习四食品中总抗坏血酸测定（荧光法）（一）目的意义食品中的总抗坏血酸包括还原型和脱氢型两种形式。
当食物放置时间较长或经过烹调处理后，其中有相当一部分抗坏血酸转变为脱氢型，脱氢型的抗坏血酸仍有85％左右的维生紊C活性，因此对这类食物常常测定总抗坏血酸。
（二）原理样品中还原性抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢型抗坏血酸。
脱氢型抗坏血酸与邻苯二胺反应生成有荧光的化合物恶喹啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢型抗坏血酸浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中总抗坏血酸量。
（三）仪器与试剂1. 荧光分光光度计或有338nm及340nm波长的荧光计2. 捣碎机3. 100ml容量瓶，锥形瓶，具塞试管。
4. 偏磷酸一乙酸液称取30g偏磷酸（HPO3），溶于80ml冰乙酸中，加500ml 蒸馏水混匀，稀释至1000ml。
于4℃冰箱可保存7～10天。
5. 偏磷酸一乙酸一硫酸液制法同4，只是用0.18mol／L硫酸代替蒸馏水。
6．醋酸钠溶液溶解500g醋酸钠（NaAc·3H2O）于蒸馏水中，稀释至1000ml。
7. 硼酸一醋酸钠溶液溶解3g硼酸于100ml醋酸钠溶液中，临用前配制。
8. 邻苯二胺溶液称取20mg邻苯二胺，于临用前溶解至100ml。
9. 0.04％百里酚蓝指示剂溶液称取0.lg百里酚蓝，加0.02mol／L氢氧化钠溶液在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量大约是10.75ml，研磨溶解后的溶液用水稀释至250ml。
10．活性炭的活化加200g碳粉与lL盐酸浓溶液（1份盐酸＋9份水），加热回流1～2小时，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110～120℃烘箱中干燥，备用。
11．抗坏血酸标准溶液（lmg／ml）精确称取50mg抗坏血酸，用偏磷酸—乙酸液溶解至50ml容量瓶中，稀释至刻度（临用前配）。
12. 抗坏血酸标准应用液（100ug／ml）取10ml抗坏血酸标准液用偏磷酸—乙酸液稀释至100ml。
维生素C片中抗坏血酸的测定
维生素C片中抗坏血酸的测定维生素C，也称抗坏血酸，是一种重要的水溶性维生素，具有多种生理功能。
它可以促进铁的吸收和利用，有助于皮肤伤口的愈合、提高人体免疫力，还可以对抗自由基对细胞的损害等等。
由于人体自己无法自行合成维生素C，因此必须通过饮食或补充剂的方式来摄取。
但是，维生素C很容易氧化失去活性，因此在储存过程中需要特别注意。
本文将介绍维生素C片中抗坏血酸的测定方法。
测定原理维生素C是还原型物质，具有还原性，因此可以与氧化剂I2反应，形成色素。
I2在酸性环境下氧化生成I^-，接着I^-离子与维生素C反应成光吸收值较小的I3^-络合物，即维生素C滴定终点。
根据滴定所用的溶液浓度、用量以及生成络合物的光学性质，则可以确定维生素C的含量。
实验药品和设备1.溶液：维生素C浓度为10mg/mL的标准溶液、0.1M硫酸、0.1%淀粉溶液、0.1M碘酸钾溶液、0.1M硫酸铜溶液、0.1M氢氧化钠溶液、0.01M EDTA四钠盐溶液。
2.设备：分析天平、醇灯、10mL锥形瓶、10mL直口瓶、比色皿、可调式电位计、pH 计、定容瓶、移液管等。
实验步骤1.样品准备将维生素C片粉末磨碎，并按照说明书的要求将其溶解在约10mL水中。
磨碎时应避免光照和过度摩擦，以免影响维生素C的稳定性。
溶解后的维生素C片可通过定容转移至10mL锥形瓶内。
2.标准曲线的制备取一定量的维生素C标准溶液，分别置于10mL直口瓶中，通过不同稀释倍数制备不同浓度的标准溶液，计算出维生素C的浓度范围。
然后通过滴定操作得到对应浓度的滴定体积V1。
3.测定未知样品中维生素C的含量将溶解好的维生素C片转移至100mL定容瓶中，配成100mg/L的维生素C溶液。
取0.5mL溶液，加入10mL0.1M硫酸，并进行预滴定加样，加入0.1M碘酸钾溶液，在淀粉试验液的指导下终点处停止滴定至瓶底，记录滴定体积V2。
然后，按照下列公式计算出维生素C的含量：维生素C mg/kg = (V1 - V2) × C ×50 / ns其中，C为0.1M的碘酸钾溶液浓度，ns为加入样品容积，50为维生素C溶液的稀释倍数。
食品中还原性抗坏血酸的测定
V—滴定时所用2，6-二氯酚靛酚的毫升数
C—1ml 染料相当于抗坏血酸毫克（0.05mg/ml）
W—5ml滤液中含有的样品克数 (0.25g)
100gx10gx5ml 200gx100ml =0.25g
二、原理
还原型抗坏血酸有还原性，能还原染料2，6— 二氯酚靛酚，该染料在酸性溶液中呈红色，被 还原后红色消失，当被测溶液中过量一滴染料 时即显红色，以示终点。
在无杂质干扰时，被测溶液还原染料的量与其 中所含抗坏血酸的浓度成正比。
2，6—二氯酚靛酚
H+
2，6—二氯酚靛酚
(碱性－蓝色）
(酸性－红色）
滴定至粉红色存在15秒不退为终点,记录2，6-二氯 酚靛酚的用量V1ml。测两次取其平均值; 5.用蒸馏水做空白对照，记录2，6-二氯酚靛酚的用量 V2ml. 6.计算5ml滤液中含有的样品克数W（？g）
五、计算
计算 100g 样品中还原型抗坏血酸的含量：
还原型抗坏血酸 （mg/ 100 g） V1 V2 C 100
实验报告书写内容
一、目的要求 二、实验原理 三、操作步骤 四、实验结果 五、分析讨论
说明：
• 实验报告一律使用 实验报告本；
• 学生完成实验报告 后由课代表收齐后交 给指导教师。
五、计算
计算 100g 样品中还原型抗坏血酸的含量：
还原型抗坏血酸 （mg/ 100 g） V C 100 V 20
六、注意事项
3. 样品匀浆液有颜色时，应加入一勺白陶土，振 摇脱色，过滤后，再取上层液滴定。
4. 样品中可能含有其它杂质，也能还原2，6-二氯 酚靛酚，但还原染料的速度较抗坏血酸慢，所 以滴定时以15s粉红色不退为终点。
食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定
中华人民共和国国家标准G B5009.86 2016食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定2016-08-31发布2017-03-01实施中华人民共和国前言本标准代替G B/T5009.86 2003‘蔬菜㊁水果及其制品中总抗坏血酸的测定(荧光法和2,4-二硝基苯肼法)“㊁G B/T5009.159 2003‘食品中还原型抗坏血酸的测定“和G B6195 1986‘水果㊁蔬菜维生素C含量测定法(2,6-二氯靛酚滴定法)“㊂本标准与G B/T5009.86 2003相比,主要变化如下:标准名称修改为 食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定 ;扩大了方法的适用范围;增加了高效液相色谱法及相关方法的定量限;删除了2,4-二硝基苯肼法;增加了2,6-二氯靛酚滴定法;按照G B/T20001.4 2015对原标准的结构进行了修改㊂食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定1范围本标准规定了高效液相色谱法㊁荧光法㊁2,6-二氯靛酚滴定法测定食品中抗坏血酸的方法㊂本标准第一法适用于乳粉㊁谷物㊁蔬菜㊁水果及其制品㊁肉制品㊁维生素类补充剂㊁果冻㊁胶基糖果㊁八宝粥㊁葡萄酒中的L(+)-抗坏血酸㊁D(+)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸总量的测定㊂第二法适用于乳粉㊁蔬菜㊁水果及其制品中L(+)-抗坏血酸总量的测定㊂第三法适用于水果㊁蔬菜及其制品中L(+)-抗坏血酸的测定㊂2术语和定义2.1抗坏血酸:一种具有抗氧化性质的有机化合物㊂又称为 维生素C ,是人体必需的营养素之一㊂2.2 L(+)-抗坏血酸:左式右旋光抗坏血酸㊂具有强还原性,对人体具有生物活性㊂2.3 D(+)-抗坏血酸:又称异抗坏血酸㊂具有强还原性,但对人体基本无生物活性㊂2.4 L(+)-脱氢抗坏血酸:L(+)-抗坏血酸极易被氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸,L(+)-脱氢抗坏血酸亦可被还原为L(+)-抗坏血酸㊂通常称为脱氢抗坏血酸㊂2.5 L(+)-抗坏血酸总量:将试样中L(+)-脱氢抗坏血酸还原成的L(+)-抗坏血酸或将试样中L(+)-抗坏血酸氧化成的L(+)-脱氢抗坏血酸后测得的L(+)-抗坏血酸总量㊂第一法高效液相色谱法3原理试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后,以离子对试剂为流动相,经反相色谱柱分离,其中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245n m)测定;试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后,用紫外检测器(波长245n m)测定L(+)-抗坏血酸总量,或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量㊂以色谱峰的保留时间定性,外标法定量㊂4试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂4.1试剂4.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂4.1.2磷酸三钠(N a3P O4㊃12H2O)㊂4.1.3磷酸二氢钾(K H2P O4)㊂4.1.4磷酸(H3P O4):85%㊂4.1.5 L-半胱氨酸(C3H7N O2S):优级纯㊂4.1.6十六烷基三甲基溴化铵(C19H42B r N):色谱纯㊂4.1.7甲醇(C H3O H):色谱纯㊂4.2试剂配制4.2.1偏磷酸溶液(200g/L):称取200g(精确至0.1g)偏磷酸(4.1.1),溶于水并稀释至1L,此溶液保存于4ħ的环境下可保存一个月㊂4.2.2偏磷酸溶液(20g/L):量取50m L200g/L偏磷酸溶液,用水稀释至500m L㊂4.2.3磷酸三钠溶液(100g/L):称取100g(精确至0.1g)磷酸三钠,溶于水并稀释至1L㊂4.2.4 L-半胱氨酸溶液(40g/L):称取4g L-半胱氨酸,溶于水并稀释至100m L㊂临用时配制㊂4.3标准品4.3.1 L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂4.3.2 D(+)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂4.4标准溶液配制4.4.1 L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000m g/m L):准确称取L(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01m g),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10m L㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂4.4.2 D(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000m g/m L):准确称取D(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01m g),用20g/L的偏磷酸溶液定容至10m L㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂4.4.3抗坏血酸混合标准系列工作液:分别吸取L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸标准贮备液0m L, 0.05m L,0.50m L,1.0m L,2.5m L,5.0m L,用20g/L的偏磷酸溶液定容至100m L㊂标准系列工作液中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的浓度分别为0μg/m L㊁0.5μg/m L㊁5.0μg/m L㊁10.0μg/m L㊁25.0μg/m L㊁50.0μg/m L㊂临用时配制㊂5仪器和设备5.1液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器㊂5.2p H计:精度为0.01㊂5.3天平:感量为0.1g㊁1m g㊁0.01m g㊂5.4超声波清洗器㊂5.5离心机:转速ȡ4000r/m i n㊂5.6均质机㊂5.7滤膜:0.45μm水相膜㊂5.8振荡器㊂6分析步骤整个检测过程尽可能在避光条件下进行㊂6.1试样制备6.1.1液体或固体粉末样品:混合均匀后,应立即用于检测㊂6.1.2水果㊁蔬菜及其制品或其他固体样品:取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液,经均质机均质并混合均匀后,应立即测定㊂6.2试样溶液的制备称取相对于样品约0.5g~2g(精确至0.001g)混合均匀的固体试样或匀浆试样,或吸取2m L~ 10m L液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03m g~6m g]于50m L烧杯中,用20g/L的偏磷酸溶液(4.2.2)将试样转移至50m L容量瓶中,震摇溶解并定容㊂摇匀,全部转移至50m L离心管中,超声提取5m i n后,于4000r/m i n离心5m i n,取上清液过0.45μm水相滤膜,滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的含量]㊂6.3试样溶液的还原准确吸取20m L上述离心后的上清液于50m L离心管中,加入10m L40g/L的L-半胱氨酸溶液(4.2.4),用100g/L磷酸三钠溶液调节p H至7.0~7.2,以200次/m i n振荡5m i n㊂再用磷酸调节p H 至2.5~2.8,用水将试液全部转移至50m L容量瓶中,并定容至刻度㊂混匀后取此试液过0.45μm水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]㊂若试样含有增稠剂,可准确吸取4m L经L-半胱氨酸溶液还原的试液,再准确加入1m L甲醇,混匀后过0.45μm滤膜后待测㊂6.4仪器参考条件6.4.1色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或同等性能的色谱柱㊂6.4.2检测器:二极管阵列检测器或紫外检测器㊂6.4.3流动相:A:6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵,用水溶解并定容至1L(用磷酸调p H至2.5~2.8);B:100%甲醇㊂按AʒB=98ʒ2混合,过0.45μm滤膜,超声脱气㊂6.4.4流速:0.7m L/m i n㊂6.4.5检测波长:245n m㊂6.4.6柱温:25ħ㊂6.4.7进样量:20μL㊂6.5标准曲线制作分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定,以L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]标准溶液的质量浓度(μg/m L)为横坐标,L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的峰高或峰面积为纵坐标,绘制标准曲线或计算回归方程㊂L(+)-抗坏血酸㊁D(+)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1㊂6.6试样溶液的测定对试样溶液进行测定,根据标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的浓度(μg/m L)㊂6.7空白试验空白试验系指除不加试样外,采用完全相同的分析步骤㊁试剂和用量,进行平行操作㊂7分析结果的表述试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的含量和L(+)-抗坏血酸总量以毫克每百克表示,按式(1)计算:X=(c1-c0)ˑVmˑ1000ˑFˑKˑ100(1)式中:X 试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸㊁L(+)-抗坏血酸总量]的含量,单位为毫克每百克(m g/100g);c1 样液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/m L); c0 样品空白液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/m L);V 试样的最后定容体积,单位为毫升(m L);m 实际检测试样质量,单位克(g);1000 换算系数(由μg/m L换算成m g/m L的换算因子);F 稀释倍数(若使用6.3还原步骤时,即为2.5);K 若使用6.3中甲醇沉淀步骤时,即为1.25;100 换算系数(由m g/g换算成m g/100g的换算因子)㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂9其他固体样品取样量为2g时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.5m g/100g,定量限均为2.0m g/100g㊂液体样品取样量为10g(或10m L)时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.1m g/100g(或0.1m g/100m L),定量限均为0.4m g/100g(或0.4m g/100m L)㊂第二法荧光法10原理试样中L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(O P D A)反应生成有荧光的喹唔啉(q u i n o x a l i n e),其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定试样中L(+)-抗坏血酸总量㊂注:L(+)-脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与O P D A反应,以此排除试样中荧光杂质产生的干扰㊂11试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂11.1试剂11.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂11.1.2冰乙酸(C H3C O O H):浓度约为30%㊂11.1.3硫酸(H2S O4):浓度约为98%㊂11.1.4乙酸钠(C H3C O O N a)㊂11.1.5硼酸(H3B O3)㊂11.1.6邻苯二胺(C6H8N2)㊂11.1.7百里酚蓝(C27H30O5S)㊂11.1.8活性炭粉㊂11.2试剂的配制11.2.1偏磷酸-乙酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40m L冰乙酸及250m L水,加温,搅拌,使之逐渐溶解,冷却后加水至500m L㊂于4ħ冰箱可保存7d~10d㊂11.2.2硫酸溶液(0.15m o l/L):取8.3m L硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1000m L㊂11.2.3偏磷酸-乙酸-硫酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40m L冰乙酸,滴加0.15m o l/L硫酸溶液至溶解,并稀释至500m L㊂11.2.4乙酸钠溶液(500g/L):称取500g乙酸钠,加水至1000m L㊂11.2.5硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100m L㊂临用时配制㊂11.2.6邻苯二胺溶液(200m g/L):称取20m g邻苯二胺,用水溶解并稀释至100m L,临用时配制㊂11.2.7酸性活性炭:称取约200g活性炭粉(75μm~177μm),加入1L盐酸(1+9),加热回流1h~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110ħ~120ħ烘箱中干燥10h,备用㊂检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应㊂将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述洗出滤液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀㊂11.2.8百里酚蓝指示剂溶液(0.4m g/m L):称取0.1g百里酚蓝,加入0.02m o l/L氢氧化钠溶液约10.75m L,在玻璃研钵中研磨至溶解,用水稀释至250m L㊂(变色范围:p H等于1.2时呈红色;p H等于2.8时呈黄色;p H大于4时呈蓝色)㊂11.3标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度ȡ99%㊂11.4标准品的配制11.4.1 L(+)-抗坏血酸标准溶液(1.000m g/m L):称取L(+)-抗坏血酸0.05g(精确至0.01m g),用偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至50m L,该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂11.4.2 L(+)-抗坏血酸标准工作液(100.0μg/m L):准确吸取L(+)-抗坏血酸标准液10m L,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100m L,临用时配制㊂12仪器和设备荧光分光光度计:具有激发波长338n m及发射波长420n m㊂配有1c m比色皿㊂13分析步骤整个检测过程应在避光条件下进行㊂13.1试液的制备称取约100g(精确至0.1g)试样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入捣碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂测试匀浆的酸碱度㊂如呈红色,即称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸溶液稀释;若呈黄色或蓝色,则称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其p H 为1.2㊂匀浆的取用量根据试样中抗坏血酸的含量而定㊂当试样液中抗坏血酸含量在40μg /m L ~100μg/m L 之间,一般称取20g (精确至0.01g )匀浆,用相应溶液稀释至100m L ,过滤,滤液备用㊂13.2 测定13.2.1 氧化处理:分别准确吸取50m L 试样滤液及抗坏血酸标准工作液于200m L 具塞锥形瓶中,加入2g 活性炭,用力振摇1m i n ,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即为试样氧化液和标准氧化液,待测定㊂13.2.2 分别准确吸取10m L 试样氧化液于两个100m L 容量瓶中,作为 试样液 和 试样空白液 ㊂13.2.3 分别准确吸取10m L 标准氧化液于两个100m L 容量瓶中,作为 标准液 和 标准空白液 ㊂13.2.4 于 试样空白液 和 标准空白液 中各加5m L 硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15m i n,用水稀释至100m L ,在4ħ冰箱中放置2h ~3h ,取出待测㊂13.2.5 于 试样液 和 标准液 中各加5m L 的500g /L 乙酸钠溶液,用水稀释至100m L ,待测㊂13.3 标准曲线的制备准确吸取上述 标准液 [L (+)-抗坏血酸含量10μg/m L ]0.5m L ,1.0m L ,1.5m L ,2.0m L ,分别置于10m L 具塞刻度试管中,用水补充至2.0m L ㊂另准确吸取 标准空白液 2m L 于10m L 带盖刻度试管中㊂在暗室迅速向各管中加入5m L 邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35m i n ,于激发波长338n m ㊁发射波长420n m 处测定荧光强度㊂以 标准液 系列荧光强度分别减去 标准空白液 荧光强度的差值为纵坐标,对应的L (+)-抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或计算直线回归方程㊂13.4 试样测定分别准确吸取2m L 试样液 和 试样空白液 于10m L 具塞刻度试管中,在暗室迅速向各管中加入5m L 邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35m i n ,于激发波长338n m ㊁发射波长420n m 处测定荧光强度㊂以 试样液 荧光强度减去 试样空白液 的荧光强度的差值于标准曲线上查得或回归方程计算测定试样溶液中L (+)-抗坏血酸总量㊂14 结果计算试样中L (+)-抗坏血酸总量,结果以毫克每百克表示,按式(2)计算:X =c ˑV m ˑF ˑ1001000(2)式中:X 试样中L (+)-抗坏血酸的总量,单位为毫克每百克(m g/100g );c由标准曲线查得或回归方程计算的进样液中L (+)-抗坏血酸的质量浓度,单位为微克每毫升(μg /m L );V 荧光反应所用试样体积,单位为毫升(m L );m 实际检测试样质量,单位克(g );F试样溶液的稀释倍数;100换算系数;1000换算系数㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂15精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂16其他当样品取样量为10g时,L(+)-抗坏血酸总量的检出限为0.044m g/100g,定量限为0.7m g/ 100g㊂第三法2,6-二氯靛酚滴定法17原理用蓝色的碱性染料2,6-二氯靛酚标准溶液对含L(+)-抗坏血酸的试样酸性浸出液进行氧化还原滴定,2,6-二氯靛酚被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的2,6-二氯靛酚在酸性介质中显浅红色,由2,6-二氯靛酚的消耗量计算样品中L(+)-抗坏血酸的含量㊂18试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂18.1试剂18.1.1偏磷酸(H P O3)n:含量(以H P O3计)ȡ38%㊂18.1.2草酸(C2H2O4)㊂18.1.3碳酸氢钠(N a H C O3)㊂18.1.42,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐,C12H6C l2N N a O2)㊂18.1.5白陶土(或高岭土):对抗坏血酸无吸附性㊂18.2试剂的配制18.2.1偏磷酸溶液(20g/L):称取20g偏磷酸,用水溶解并定容至1L㊂18.2.2草酸溶液(20g/L):称取20g草酸,用水溶解并定容至1L㊂18.2.32,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐)溶液:称取碳酸氢钠52m g溶解在200m L热蒸馏水中,然后称取2,6-二氯靛酚50m g溶解在上述碳酸氢钠溶液中㊂冷却并用水定容至250m L,过滤至棕色瓶内,于4ħ~8ħ环境中保存㊂每次使用前,用标准抗坏血酸溶液标定其滴定度㊂标定方法:准确吸取1m L抗坏血酸标准溶液于50m L锥形瓶中,加入10m L偏磷酸溶液或草酸溶液,摇匀,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色,保持15s不褪色为止㊂同时另取10m L偏磷酸溶液或草酸溶液做空白试验㊂2,6-二氯靛酚溶液的滴定度按式(3)计算:T=cˑVV1-V0 (3)式中:T 2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数,单位为毫克每毫升(m g/m L);c 抗坏血酸标准溶液的质量浓度,单位为毫克每毫升(m g/m L );V 吸取抗坏血酸标准溶液的体积,单位为毫升(m L );V 1 滴定抗坏血酸标准溶液所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );V 0 滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L )㊂18.3 标准品L (+)-抗坏血酸标准品(C 6H 8O 6):纯度ȡ99%㊂18.4 标准溶液的配制L (+)-抗坏血酸标准溶液(1.000m g /m L ):称取100m g (精确至0.1m g)L (+)-抗坏血酸标准品,溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100m L ㊂该贮备液在2ħ~8ħ避光条件下可保存一周㊂19 测定整个检测过程应在避光条件下进行㊂19.1 试液制备:称取具有代表性样品的可食部分100g ,放入粉碎机中,加入100g 偏磷酸溶液或草酸溶液,迅速捣成匀浆㊂准确称取10g ~40g 匀浆样品(精确至0.01g )于烧杯中,用偏磷酸溶液或草酸溶液将样品转移至100m L 容量瓶,并稀释至刻度,摇匀后过滤㊂若滤液有颜色,可按每克样品加0.4g 白陶土脱色后再过滤㊂19.2 滴定:准确吸取10m L 滤液于50m L 锥形瓶中,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉红色15s 不褪色为止㊂同时做空白试验㊂20 结果计算试样中L (+)-抗坏血酸含量按式(4)计算:X =(V -V 0)ˑT ˑAmˑ100 (4)式中:X 试样中L (+)-抗坏血酸含量,单位为毫克每百克(m g/100g );V 滴定试样所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );V 0 滴定空白所消耗2,6-二氯靛酚溶液的体积,单位为毫升(m L );T 2,6-二氯靛酚溶液的滴定度,即每毫升2,6-二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数(m g/m L ); A 稀释倍数;m 试样质量,单位为克(g)㊂计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字㊂21 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值,在L (+)-抗坏血酸含量大于20m g/100g 时不得超过算术平均值的2%㊂在L (+)-抗坏血酸含量小于或等于20m g /100g 时不得超过算术平均值的5%㊂G B 5009.86 20169 附 录 AL (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图 第一法L (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图见图A.1㊂图A .1 L (+)-抗坏血酸㊁D (+)-抗坏血酸标准色谱图。
实验八食品中总抗坏血酸的测定(2,4-二硝基苯肼比色法)
实验八食品中总抗坏血酸的测定（2，4-二硝基苯肼比色法）Method for determination of ascorbic acid in foods（by colorimetry with 2,4-dinitrophenylhydrazine）(一)目的掌握2，4-二硝基苯肼比色法测定食品中总抗坏血酸含量。
(二)原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色定量。
(三)仪器与试剂1.仪器和设备1.1 恒温箱(37±0.5)℃。
1.2 可见—紫外分光光度计1.3 捣碎机2.试剂本实验用水均为蒸馏水。
试剂纯度均为分析纯。
2.1 4.5 mol／L硫酸谨慎地加250mL硫酸(相对密度 1.84)于700 mL水中，冷却后用水稀释至1000 mL。
2.2 85％硫酸谨慎地加900 mL硫酸(相对密度 1.84)于100 mL水中。
2.3 2％2，4—二硝基苯肼溶液溶解2g 2，4—二硝基苯肼于100 mL 4.5 mol／L 硫酸内，过滤。
不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。
2.4 2％草酸溶液溶解20g草酸(H2C2O4)于700 mL水中，稀释至1000mL。
2.5 1％草酸溶液稀释500mL 2％草酸溶液到1000mL。
2.6 1％硫脲溶液溶解5g硫脲于500 mL 1％草酸溶液中。
2.7 2%硫脲溶液溶解10g硫脲于500mL 1％皋酸溶液中。
2.8 l mol／L盐酸取100mL盐酸，加入水中，并稀释至1200 mL。
2.9 抗坏血酸标准溶液溶解100mg纯抗坏血酸于100 mL l％草酸中，配成每毫升相当于l mg抗坏血酸。
2.10 活性炭将100g活性炭加到750mL l mol／L盐酸中，回流1—2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe3+)为止，然后置于110℃烘箱中烘干。
食物中还原型抗坏血酸的测定
食物中还原型抗坏血酸的测定2,6-二氯酚靛酚法1. 测定原理还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。
还原型抗坏血酸还原2,6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。
在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2,6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。
2. 仪器设备高速组织捣碎机分析天平漏斗锥形瓶：50ml容量瓶：250ml微量滴定管：5ml烧杯：250ml、50ml移液管：5ml、2ml、1ml3. 试剂1％草酸溶液2％草酸溶液2,6-二氯酚靛酚溶液20%抗坏血酸标准溶液0.001N碘酸钾标准溶液6%碘化钾溶液1%淀粉溶液4. 样品甘蓝、青椒、菜花、桔子、猕猴桃5. 操作步骤与计算（1）标准维生素C溶液的标定（2）2,6-二氯酚靛酚（染料）标定（3）样品中维生素C的测定6. 注意事项（1）微量滴定管的使用：a量程5ml，每小格0.02mlb每过量一滴即2-3小格，掌握好终点c加样时易产生气泡，要注意d接头易碎，要小心使用（2）样品取样后，应浸泡在已知量的2%草酸中，以免氧化，测定过程要迅速。
（3）测定样品时必须同时作一空白对照，样品溶液滴定的毫升数须扣除空白液滴定的毫升数。
（4）滴定开始时，染料应迅速加入，直至红色不立即消失，以后逐滴加入，并不断振荡，直到粉红色15s内不褪色为止。
样品中可能有其他杂质也能还原2,6-二氯酚靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15s红色不褪为终点。
橘子中还原型抗坏血酸的测定-华北理工大学教务处
营养与食品卫生学实习指导华北煤炭医学院预防医学系营养与食品卫生学学科营养与食品卫生学实习指导周瑞华宁鸿珍唐咏梅刘辉编著2008-4目录实验一、蛋白质功效比值的课题设计 (3)实验二、荧光法测定食物中的核黄素 (10)实验三、食品中还原型抗坏血酸的测定 (13)实验四、营养调查 (17)实验五、食品中亚硝酸盐含量测定 (24)实验六、鲜奶的卫生质量检验 (26)实验七、食用油脂的卫生检验 (30)实习八、白酒中甲醇的测定 (33)实习九、营养卫生音像 (35)实习十、食品卫生音像 (35)实验一蛋白质功效比值的课题设计一、学习内容(一)目的、意义与应用本实验的目的在于掌握蛋白质功效比值(PER)的概念及意义，了解动物实验的设计、分组及动物饲料的配制等。
蛋白质功效比值(PER)：是测定蛋白质生物利用率最常用的方法，其定义为在严格规定的条件下，处于生长发育期的幼龄动物每摄入1g待测蛋白所增加的体重克数。
本方法是美国公职分析化学协会(AOAC)推荐的测定食物蛋白质营养效应的官方标准之一，国际上广泛应用。
本方法方便、具体，但由于没有考虑维持生命所需蛋白质的量，动物摄入的蛋白质克数与体重增加之间并不成线性关系。
常以已经标定的酪蛋白(标准参考蛋白)的PER值为2.5，以此校正测得的PER值。
本法适用于含氮量高于1.80%的物质。
(二) 实验动物及分组要求用同一来源、同一品系、年龄相近、刚断奶(出生21～28天)的雄性大鼠。
动物在实验室适应3-7天才能投入实验使用。
每一种待测样品设一个实验组，外加一个参考(标准)酪蛋白组(阳性对照组)。
大鼠按体重顺序，以随机区组法分组，每组动物不少于10只，每组动物数相同。
各组动物平均体重组间差不大于5g，组内个体差不大于10g。
(三) 动物饲料配方在配制饲料前，应先测定样品中各种营养素的含量(蛋白质、脂肪、水分、纤维素和灰分)，以使各组实验饲料及参考酪蛋白组饲料间各种营养素相等（达到AOAC标准)，其中蛋白质含量控制在9.09%，使之相互之间具有可比性。
食品中维生素C含量的测定实验
实验3 食品中维生素C含量的测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）一、实验原理维生素C又称抗坏血酸，还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。
2，6-二氯酚靛酚的钠盐水溶液呈蓝色，在酸性溶液中呈玫瑰红色，当其被还原时就变为无色，因此，可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸。
当抗坏血酸完全被氧化后，稍多加一点染料，使滴定液呈淡红色，即为终点。
如无其他杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。
二、试剂和器材偏磷酸醋酸溶液：取15g（用时研细）溶于40mL醋酸及20mL水的混合液中，然后用水稀释至500mL，过滤后储入试剂瓶中。
标准2，6-二氯酚靛酚溶液：取0.25g2，6-二氯酚靛酚溶于700mL蒸馏水中（用力搅动），加入300mL磷酸缓冲液（预先配制9.078g/L KH2PO4-11.867g/LNa2HPO4·2H2O水溶液，用时以KH2PO4：Na2HPO4·2H2O=4：6的比率将其混合，pH值为6.9-7.0），翌日过滤，滤液储于棕色瓶中，临用时，以抗坏血酸溶液标定。
标准维生素C溶液：以少量偏磷酸醋酸溶液溶解0.1g维生素C于100mL容量瓶中，再以该液稀释至刻度。
2，6-二氯酚靛酚液的标定：在3个100mL锥形瓶中，各置5mL偏磷酸醋酸液，再各加2mL标准维生素C溶液，摇匀。
用上面所制的标准2，6-二氯酚靛酚液滴定，呈玫瑰红色保持30s不褪色为止。
记下所用2，6-二氯酚靛酚溶液体积平均值，再以同样方法做一空白实验，取7mL偏磷酸醋酸液加水若干毫升（相当于以上所用的2，6-二氯酚靛酚溶液的低定量），仍用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。
将第一次滴定的量减去空白实验的量，即为标准维生素的反应量，求出1mL 2，6-二氯酚靛酚对应于维生素C的质量（mg）。
研钵、容量瓶、剪刀、锥形瓶、微量滴定管三、实验步骤1、用自来水冲洗果蔬样品，再以蒸馏水清洗，用纱布或吸水纸吸干表面水分，然后称取25g，剪碎，在研钵中研呈浆状。
抗坏血酸(维生素C)的测定方法
抗坏血酸(维生素 C )的测定方法(1)在测定维生素C 的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素 C 含量的第一标准方法，2、4 —二硝基苯肼法作为第二法。
一、荧光法 1 •原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后， 与邻苯二胺(OPDA 反应生 成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline ),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正 比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA 反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。
本方法的最小检出限为 0.022 g/ml 。
2. 适用范围 GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定3•仪器3. 1 •实验室常用设备。
3. 2.荧光分光光度计或具有 350nm 及430nm 波长的荧光计。
3. 3.打碎机。
4. 试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
(1 )偏磷酸—乙酸液：称取 15g 偏磷酸，加入40ml 冰乙酸及250ml 水，搅拌，放置过夜使 之逐渐溶解，加水至 500ml 。
4C 冰箱可保存 7〜10天。
(2)0.15 mol/L 硫酸：取10ml 硫酸，小心加入水中，再加水稀释至 1200ml 。
(3)偏磷酸—乙酸—硫酸液：以 0.15mol/L 硫酸液为稀释液，其余同 4.1.配制。
(4) 50% 乙酸钠溶液：称取 500g 乙酸钠(CH3COONa3H2O ，加水至1000ml 。
(5) 硼酸-乙酸钠溶液：称取 3g 硼酸，溶于100ml 乙酸钠溶液(4.4 )中。
临用前配制。
(6)邻苯二胺溶液：称取 20mg 邻苯二胺，于临用前用水稀释至 100ml 。
(7)0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取 0.1g 百里酚蓝，加0.02mol/L 氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为 10.75ml ，磨溶后用水稀释至 250ml 。
食物中还原型抗坏血酸的测定实验报告
食物中还原型抗坏血酸的测定一、实验目的1.了解食物中抗坏血酸测定的意义2.掌握食物中抗坏血酸测定的基本原理和方法.二.实验原理抗坏血酸在新鲜的食物中主要以还原型的形式存在，故可以利用它的强还原性还原染料2，6一=氯酚靛酚而测定。
用标准碘酸钾溶液标定抗坏血酸溶液，然后以标定的抗坏血酸溶液标定2，6一=氯酚靛酚染料溶液，再用此染料滴定样品中的抗坏血酸。
2，6—=氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，被还原后红色褪去.当被测溶液中过量1滴染料时又呈现红色，即为滴定终点。
在无杂质干扰时，被测溶液还原染料的量与其中所含抗坏血酸的浓度成正比还原型抗坏血酸+染料（红色）→脱氢型抗坏血酸+染料（无色）三、试剂1.1％、2％草酸溶液，白陶土，2.6—=氯酚靛酚溶液四.仪器烧杯，组织捣碎机、漏斗、滤纸、锥形烧瓶、微量滴定管、容量瓶、吸管五.操作步骤.1.样品洗净风干后，取适量均匀样品（100g）稍加切碎后，迅速加入等量2％草酸溶液.2.放入组织捣碎机中打成匀浆3.称取10g匀浆于小烧杯中，小心地以1％草酸将样品洗入100ml量简中，稀释至刻度摇匀。
4.如取出部分溶液于50ml具塞量筒中，振摇数次，沉静置沉淀5.取中层液过滤，吸取滤液10ml，以标定过的2，6一=氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈现淡红色，在15s内不退色为止6.用蒸馏水作空白滴定，如果料太浓，应适当稀释六.计算抗坏血酸（mg/100g）={（V1-V2）XT}/wx100W=100/(100+100)x(10/50)x10=1抗坏血酸={（1.88+132）/2-0.15）×T}/1x100=14.28 mg/100g V1:样品滴定时所用的染料毫升数.V2:空白滴定时所用的染料毫升数T:ImL染料所能氧化抗坏血酸的mg数W:滴定时所用样品稀释液中含样品克数七.注意事项.1.操作过程要迅速，因还原性抗坏血酸易被氧化.2.生食物的匀浆在容量瓶内振摇后可能有泡沫，可用戊醇数滴除去3.滴定开始时，染料溶液要迅速加入，自至红色立即消失，然后尽可能地一滴滴加入，并不断振摇.直呈粉红色15s不消失为止.样品中可能有其它杂质也能还原2，6一=氯酚靛酚，但其还原染料的速度均较抗坏血酸慢，所以滴定时以15s 粉红色不退为止.。
水果及蔬菜中抗坏血酸含量的测定_doc
水果及蔬菜中维生素C含量的定量测定范开祥金文党承兰徐娇（河西学院生命科学与工程系08级（2）班甘肃张掖734000）摘要本文以橙子，猕猴桃，青椒为材料，用实验室通用的2，6-二氯酚靛酚法测定维生素C的含量。
还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚钠盐，本身则氧化成脱氢抗坏血酸。
在酸性溶液中，2，6-二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。
因此，可用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中的还原型抗坏血酸。
如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。
关键词抗坏血酸2，6—二氯酚靛酚2%草酸引言橙子（学名：Citrus sinensis）是芸香科柑橘属植物橙树的果实，常绿小乔木，高达4～6米。
枝细长，有长棘针。
花期春季，果期秋季。
橙子又称黄果。
原产中国南部，南方各省均有分布，而以四川、广东、台湾等省栽培较为集中。
15世纪初从中国传入欧洲，15世纪末传入美洲，我国江苏、浙江、安徽、江西、湖北、湖南、四川、云南、贵州等地均有栽培。
果圆形至长圆形，橙黄色，油胞凸起，果皮不易剥离。
无苦味。
中心柱充实；汁味甜而香。
含有大量的糖和一定量的柠檬酸以及丰富的维生素C，营养价值较高。
果实还含维生素P，具极高的医药价值。
橙子味甘、酸，性凉。
具有生津止渴、开胃下气的功效。
正常人饭后食橙子或饮橙汁，有解油腻、消积食、止渴、醒酒的作用。
橙子营养极为丰富而全面，事实上，它的维生素C含量丰富，能增强人体抵抗力，亦能将脂溶性有害物质排出体外，是名实相符的保安康抗氧化剂。
橙皮又叫黄果皮，除含果肉中的成分外，胡萝卜素含量较多，可作为健胃剂、芳香调味剂。
橙皮还含一定时的橙皮油，对慢性支气管炎有效。
猕猴桃（学名：Actinidia chinensis Planch）是猕猴桃科植物，落叶藤本；枝褐色，有柔毛，髓白色，层片状。
猕猴桃的适应性强，喜温、喜湿，常在阴湿的林边、荒坡或灌木丛中生长，不耐旱，也不很抗冻；猕猴桃的根系发达，生长旺盛。
抗坏血酸的测定方法
抗坏血酸（Vc）的测定方法测定Vc的国标方法中，荧光法为测定食物中Vc含量的第一标准方法，2、4－二硝基苯肼法作为第二法。
一、荧光法1．原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。
本方法的最小检出限为0.022 g/ml。
2．适用范围GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定3．仪器3．1．实验室常用设备。
3．2．荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
3．3．打碎机。
4．试剂本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。
（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。
4℃冰箱可保存7～10天。
（2）0.15 mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。
（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。
（4）50％乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。
（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。
临用前配制。
（6）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。
（7）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。
变色范围：pH=1.2 红色pH=2.8 黄色pH＞4.0 兰色（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。
实验二 固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸
（三）仪器与试剂 1．试剂 mol／ mL冰醋酸 冰醋酸， mL。 （1） 2 mol／L乙酸溶液 吸取 11.6 mL冰醋酸，加水稀释至 100 mL。 0.5mol／ 乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀释至100 mL。 29mL冰醋酸 （2） 0.5mol／L乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀释至100 mL。 0.25mol／ 3g乙二胺四乙酸二钠 乙二胺四乙酸二钠（ （3） 0.25mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液称取 9. 3g乙二胺四乙酸二钠（C10H14 加水并加热使之溶解，冷却并稀释至100 mL。 N2O8 Na2·2H2O）加水并加热使之溶解，冷却并稀释至100 mL。 （4）蛋白质沉淀剂 g乙酸锌 Zn（ 乙酸锌［ COO） ］，加 3mL冰醋酸溶 ①乙酸锌溶液称取 22.0 g乙酸锌［Zn（CH3COO）2·2H2O］，加 3mL冰醋酸溶 于水并稀释至100 mL。。 于水并稀释至100 mL。。 g亚铁氰化钾 亚铁氰化钾［ Fe（CN） ］，加水溶解至 ②亚铁氰化钾溶液称取 10.6 g亚铁氰化钾［K4Fe（CN）6· 3H2O］，加水溶解至 mL。 100 mL。 B） g固蓝盐 （5）显色剂固蓝盐 B（Fast Blue Salt B）溶液准确称取 0.2 g固蓝盐 B，加水于 100mL棕色容量瓶中定容 该溶液在室温下贮存可稳定3d以上。 棕色容量瓶中定容。 3d以上 100mL棕色容量瓶中定容。该溶液在室温下贮存可稳定3d以上。 抗坏血酸标准储备溶液精密称取0 g抗坏血酸 抗坏血酸， mol／ （6）抗坏血酸标准储备溶液精密称取0．2000 g抗坏血酸，加 20mL 2 mol／L 乙酸溶液， mL棕色容量瓶中 用水定容并混匀。 棕色容量瓶中， 乙酸溶液，溶解后移入 100 mL棕色容量瓶中，用水定容并混匀。此溶液相当于 mg／mL抗坏血 2.0 mg／mL抗坏血 10℃下冰箱内贮存可稳定2d 2d）。 酸（10℃下冰箱内贮存可稳定2d）。 mL抗坏血酸标准储备溶液 （7）抗坏血酸标准使用溶液用移液管精密吸取 5.0 mL抗坏血酸标准储备溶液 mL棕色容量瓶内 棕色容量瓶内。 2mol／ 乙酸溶液并用水定容。 于100 mL棕色容量瓶内。加 5 mL 2mol／L乙酸溶液并用水定容。此溶液相当于 µg／mL抗坏血酸 临用时配制）。 抗坏血酸（ 100 µg／mL抗坏血酸（临用时配制）。
食品中还原型抗坏血酸的测定
食品中还原型抗坏血酸的测定1 范围本标准规定了食品中抗坏血酸的分光光度法。
本标准适用于各类食品中的还原型抗坏血酸的测定。
本标准不适用于脱氢行抗坏血酸的测定。
2 原理在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼–2–羟基丁酰内酯衍生物，在最大吸收波长420处测定吸光度，与标准系列比较定量。
3 试剂3.1 乙酸溶液（12%）：吸收12mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
3.2 乙酸溶液（ 2%）：吸收 2mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
3.3 乙二胺四乙酸二钠溶液（35g/L）：称取 3.5g乙二胺四乙酸二钠[C10H14N2O8Na·2H2O]于水中，加热使之溶解后，放冷，并稀释至100 mL。
3.4 蛋白沉淀剂3.4.1 乙酸锌溶液（220g/L）：称取22.0g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O],加3 mL冰乙酸溶于水，并稀释至100 mL。
3.4.2 亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)4·3H2O],加水溶解至100 mL。
3.5 显色剂：固蓝盐B（Fast Blue Salt B）溶液（2g/L）：准确称取0.3125g 固蓝盐B，加水溶解于100 mL。
3.6 抗坏血酸标准储备溶液（2.0mg/mL）：精密称取0.2000g抗坏血酸，加20 mL 乙酸溶液（12%），溶解后移入100 mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
此溶液每毫升相当于2.0mg抗坏血酸（10℃下冰箱内贮存在2d内稳定）。
3.7 抗坏血酸标准使用液（0.1g/L）：用移液管精密吸取5.0 mL抗坏血酸标准储备溶液（2.0g/L）于100 mL棕色容量瓶内，加5 mL乙酸溶液（12%），用水稀释至刻度，混匀。
此溶液每毫升相当于100μg/mL抗坏血酸（临用时配制）。
4 仪器4.1 分光光度计。
4.2 捣碎机。
4.3 离心沉淀机。
4.4 10mL具塞玻璃比色管。
尖椒中还原型抗坏血酸的测定
尖椒中还原型抗坏血酸的测定1 前言抗坏血酸（抗坏血酸）是一个含有六个碳原子的酸性多羟化合物。
因为抗坏血酸很容易失去电子，是一个很好的电子供体，因此具有很强的还原剂。
抗坏血酸纯品无色、无臭、有酸味、溶于水，不溶于有机溶剂，极易被氧化，在酸性环境中稳定[1]。
抗坏血酸具有很好的抗氧化活性和自由基清除能力，它可通过逐级供给电子而转变为单氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，以达到清除自由基的目的，在氧化作用中发挥巨大作用[2]。
抗坏血酸在组织中有两种形式存在，即还原型抗坏血酸与氧化型抗坏血酸（脱氢型）。
这两种形式都有活性，并可以通过氧化还原相互转化，人体血浆中的抗坏血酸，还原型：氧化型比例约为15：1。
因此，测定还原型抗坏血酸的含量即可以了解人体内的抗坏血酸的水平[3]。
本文拟通过2,6-二氯酚靛酚滴定法测定市售尖椒中还原型抗坏血酸的的含量以评价尖椒的营养价值。
2 材料和方法2.1 实验材料2016年11月8日早晨购买的尖椒共三根。
2.2 实验方法分别称取3份10g的尖椒，立即加入10ml2%草酸，制成匀浆；用1%草酸冲洗入尖椒匀浆100ml至具塞量筒，消泡、定容；过滤后取1ml滤液和4ml1%草酸用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定，至变为浅红色且15s内不褪色；同时另取5mL1%草酸做空白滴定；根据所获数据分别计算出三个平行尖椒样品中抗坏血酸的含量。
2.3 评价标准以《中国食物成分表（2014版）》为评价标准。
2.4 数据分析用SPSS 20.0统计软件包进行数据处理、分析，统计检验水准为α= 0.05。
3 结果3.1 结果计算还原型抗坏血酸（mg/100g）=（V1-V2）×T/W×100，公式中，V1为样品滤液消耗染料体积ml数，V2为空白对照消耗染料体积ml数，T 为1ml染料所能氧化抗坏血酸的毫克数即0.0535mg，W为滴定时所用滤液中含有样品的克数。
3.2 尖椒样品中抗坏血酸的含量三个平行样品所消耗的染料体积如表1；空白对照消耗染料体积为0.16ml，各组还原型抗坏血酸含量测定的精密度分析如表2，将均数记为各组还原型抗坏血酸的含量。
营养与食品卫生实习指导
实习一还原型抗坏血酸测定（2,6–二氯酚靛酚滴定法）一、目的意义新鲜食品中的抗坏血酸主要以还原型的形式存在，测定还原型抗坏血酸可粗略了解该食品中抗坏血酸浓度的高低。
二、原理还原型抗坏血酸可将染料2,6–二氯酚靛酚还原。
用标准碘酸钾溶液标定抗坏血酸溶液，然后以标定的抗坏血酸溶液标定2,6–二氯酚靛酚染料溶液，再用此染料滴定样品中的抗坏血酸。
2,6–二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，被还原后红色褪去。
当被测溶液过量1滴染料时即显红色，以示终点。
在无杂质干扰时，被测溶液还原染料的量与其中所含抗坏血酸浓度成正比。
三、仪器与试剂1、组织捣碎机2、微量滴定管，锥形烧瓶3、100ml具塞量筒4、1%草酸，2%草酸5、白陶土6、0.01mol/L 碘酸钾标准储备液：精密称取干燥的碘酸钾（GR级或AR级）0.2140克，用蒸馏水溶解于100ml容量瓶中并定容至刻度。
7、0.001mol/L 碘酸钾标准应用液：取碘酸钾标准储备液10ml稀释至100ml。
此液1ml 相当于抗坏血酸0.088克。
8、1%淀粉溶液：称取可溶性淀粉0.5克，加水1滴，搅拌成糊状后倒入50ml沸水中，混匀，冷藏待用。
9、6%碘酸钾溶液：称取碘酸钾0.6克溶解于10ml蒸馏水中，临用前配制。
10、抗坏血酸溶液：称取纯抗坏血酸粉末20mg，用1%草酸溶解于100ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，冷藏保存。
11、碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠40.2克，溶解在200ml沸水中。
12、2,6–二氯酚靛酚：称取2,6–二氯酚靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠热溶液中，冷却后放冰箱中，过夜，次日过滤在250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，贮于棕色瓶中，冷藏保存。
四、操作步骤1、2,6–二氯酚靛酚溶液的标定（1）抗坏血酸标准溶液的标定：吸取抗坏血酸溶液2ml 于锥形瓶中，再加入1%草酸5ml ，6%碘酸钾溶液0.5ml ，1%淀粉溶液2滴，再以0.001mol/L 碘酸钾标准溶液滴定至终点为淡蓝色。
实验三 食品中维生素C的测定完美版PPT
血酸的量(mg／mL)
▪ （8）2，6— 二氯靛酚溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml 沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠 的溶液中，待冷，置于冰箱中过夜，次日过滤置于250mL量瓶 中，用水稀释至刻度，摇匀。此液应贮于棕色瓶中并冷藏， 每星期至少标定1次。
▪ 标定方法：取5mL已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1％草 酸溶液5mL，摇匀，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉红 色于15秒不褪色为止
▪ 2. 称取10.00-20.00克匀浆(使其含有抗坏血酸1-5mg)，置于 小烧杯中，小心地以1％草酸溶液将样品移入100毫升量筒中， 并稀释至刻度，摇匀，静置，过滤；
▪ 3. 将样液过滤，弃去最初毫升滤液。若样液具有颜色，用白 陶土(应选择脱色力强但对抗坏血酸无损失的白陶土)去色， 然后迅速吸取5-l0ml滤液，置于50ml三角烧瓶中，用标定的 2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉红色于15秒内不 褪色为止；
▪ 标定：吸取标准使用液5mL于三角烧瓶中，加入6 ％碘化钾溶液0.5mL，1％淀粉溶液3滴，再以 0.001N碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。
▪ 计算如下：
每毫升染料溶液相当于Vc的毫克数 T=
计算式中W应如何换算？
▪ 抗坏血酸浓度（mg/mL）= 用蒸馏水作空白滴定，如染料浓度过高，应适当稀释。
三、实验器材
▪ 1. 仪器：果汁机；大、小烧杯（250 mL、50 mL）；锥形瓶；100 mL具 塞量筒；5 mL移液管；微量滴定管；漏斗、滤纸、吸耳球等。
▪ 2. 试剂： ▪ （1）2%草酸：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000mL。 ▪ （2）1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500mL，用水稀释至1000mL。 ▪ （3）1％淀粉溶液。 ▪ （4）6％碘化钾溶液。 ▪ （5）0.1000N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水
维生素C的测定
实验三 食品中维生素C 的测定维生素C 也称抗坏血酸，分有还原性抗坏血酸与脱氢抗坏血酸。
它们在人体中的生理效应大体相等。
因此，表示食品中维生素c 总含量应该是这两种成份的总量。
另外，作为与食品品质相关成份的测定，目的在于评价栽培、收获、流通、加工等各阶段中的品质变化，此时需要分别求出还原性抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量与二者之间的比例。
1、还原性抗坏血酸的测定——碘滴定法一、原理还原性维生素C （抗坏血酸）的测定是利用碘和还原性维生素C 反应，根据消耗的碘的量，可以计算出被测物质中还原性维生素C 的含量。
其反应如下：(去氢抗坏血酸)用本方法只能测定还原型维生素C ，不能测定去氢抗坏血酸及结合态抗坏血酸，这是本法的缺点。
二、仪器及原理1．仪器：滴定管、容量瓶2．试剂（1）8%HAc ，自配100mL（2）0.2%淀粉溶液，自配50 mL（3）待标定的标准碘溶液（4）标准硫代硫酸钠溶液三、测定步骤1.样品中维生素C 的提取准备称取20克左右辣椒，分次加入10 mL8%HAc 溶液，边加边研（为增加研磨效果，可在研钵中加入一小勺清洁的砂子）；直至研碎为止。
将提取液用脱脂棉滤入250 mL容量瓶中（尽量不将固形物倒进漏斗），研钵中固形物再加10 mL8%HAc溶液如前法提取，共提取三次。
最后一次将残渣全部移到漏斗中，并用少量醋酸溶液冲洗漏斗、玻棒、研钵，各次提取液和洗液均滤入同一容量瓶中，用8%HAc稀释至刻度，摇匀。
提取液如有颜色妨碍滴定终点观察时，须用吸附剂脱色。
每10 mL溶液中加约5克陶土，于250 mL锥形瓶中摇2分钟，过滤，取清液进行滴定。
对于辣椒样品，若做好过滤操作，滤液应为澄清透明。
2.I2标准溶液的标定吸取硫代硫酸钠（Na2S2O3）标准溶液25.00 mL，置于250 mL锥形瓶中，加入25 mL水、5 mL0.2%淀粉溶液（做指示剂），用待标定的I2溶液滴定至溶液恰呈稳定的兰色，即为终点。
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食品中还原型抗坏血酸的测定
1 范围
本标准规定了食品中抗坏血酸的分光光度法。
本标准适用于各类食品中的还原型抗坏血酸的测定。
本标准不适用于脱氢行抗坏血酸的测定。
2 原理
在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰肼–2–羟基丁酰内酯衍生物，在最大吸收波长420处测定吸光度，与标准系列比较定量。
3 试剂
3.1 乙酸溶液（12%）：吸收12mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
3.2 乙酸溶液（2%）：吸收2mL冰乙酸，加水稀释至100mL。
3.3 乙二胺四乙酸二钠溶液（35g/L）：称取 3.5g乙二胺四乙酸二钠[C10H14N2O8Na·2H2O]于水中，加热使之溶解后，放冷，并稀释至100 mL。
3.4 蛋白沉淀剂
3.4.1 乙酸锌溶液（220g/L）：称取22.0g乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O],加3 mL冰乙酸溶于水，并稀释至100 mL。
3.4.2 亚铁氰化钾溶液（106g/L）：称取10.6g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)4·3H2O],加水溶解至100 mL。
3.5 显色剂：固蓝盐B（Fast Blue Salt B）溶液（2g/L）：准确称取0.3125g固蓝盐B，加水溶解于100 mL。
3.6 抗坏血酸标准储备溶液（2.0mg/mL）：精密称取0.2000g抗坏血酸，加20 mL 乙酸溶液（12%），溶解后移入100 mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
此溶液每毫升相当于2.0mg抗坏血酸（10℃下冰箱内贮存在2d内稳定）。
3.7 抗坏血酸标准使用液（0.1g/L）：用移液管精密吸取5.0 mL抗坏血酸标准储备溶液（2.0g/L）于100 mL棕色容量瓶内，加5 mL乙酸溶液（12%），用水稀释至刻度，混匀。
此溶液每毫升相当于100μg/mL抗坏血酸（临用时配制）。
4 仪器
4.1 分光光度计。
4.2 捣碎机。
4.3 离心沉淀机。
4.4 10mL具塞玻璃比色管。
5 分析步骤
5.1 试样溶液的制备
5.1.1 非蛋白性食
5.1.1.1 液体试样：抗坏血酸含量在0.2g/L以下的试样，混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量在0.2g/L以上的试样，用水适量稀释后测定。
5.1.1.2 水溶性固体试样：准确称取1.0g～5.0g精确至0.001g（含0.2g/kg以下抗坏血酸）放入乳钵中，加5mL乙酸溶液（12%）研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶内，加水稀释至刻度。
5.1.1.3 蔬菜、水果：称取鲜样可食部分20.0g～50.0g于捣碎机内，加同倍量的乙酸溶液（12%）捣成匀浆。
称取10.0g～20.0g匀浆（含0.2g/kg以下抗坏血酸）于100mL棕色容量瓶内，加5mL乙酸溶液（12%），用水稀释至刻度，混匀。
滤纸过滤，滤液备用。
不易过滤的试样可用离心机离心后，上清液供测定。
5.1.2 蛋白性食品（奶粉、豆粉、乳饮料、强化食品等）：固体试样混匀后精密称取5.0g～10.0g，精确至0.001g；液体试样用移液管精密吸取5.0mL～10.0mL于100mL棕色容量瓶内。
加10mL乙酸溶液（12%），乙酸锌溶液（220g/L）和亚铁氰化钾溶液（106g/L）各7.5mL，加水至刻度，混匀。
将全部溶液移入离心管内，以3000r/min离心10min,上清液供测定。
同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白试验。
5.2 标准曲线的绘制
精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL抗坏血酸标准使用溶液，分别置于25 mL比色管中。
各加2 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（35g/L）、2mL乙酸溶液（2%）、2.0 mL固蓝盐B溶液（2g/L），加水稀释至刻度，混匀。
室温（20℃～25℃）下放置20min后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长420nm处测量吸光度，以标准各点吸光度绘制标准曲线。
5.3 试样测定
5.3.1 非蛋白试样的测定：精密吸取按5.1.1制备的试样溶液0.5mL～5.0mL（相当于抗坏血酸200μg以下）于25 mL比色管内。
以下按5.2自―0.3 mL乙二胺四乙酸二钠溶液（35g/L）….‖起依法操作。
试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量。
5.3.2 蛋白试样的测定：精密吸取按5.1.2制备的试样溶液（约相当于抗坏血酸200μg以下）和等量试剂空白溶液（0.5mL～5.0mL），各于25 mL比色管内。
各加1.5mL乙二胺四乙酸二钠溶液（35g/L）、1.0 mL乙酸溶液（2%）、2.0mL固蓝盐B溶液（2g/L），加水稀释至刻度，混匀。
室温（20℃～25℃）下放置3min 后，移入1cm比色皿内，以试剂空白为参比，于波长420nm处测量吸光度，试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量。
6 结果计算
按下式计算
式中：
X —试样中抗坏血酸的含量，单位为毫克每百克（毫克每百毫升）
[mg/100g(mg/100mL)];
c —试样测定液中抗坏血酸的含量，单位为微克（μg ）；
m —试样质量（体积）。
单位为克（毫升）[g(mL)];
V 2—试样处理液总体积，单位为毫升（mL ）；
V 1—测定时所取溶液体积，单位为毫升（mL ）；
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
12c 100m 1000X V V =⨯⨯⨯。