考染方法一种
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
推荐郭尧君老师使用一种考染的方法
⑴ 电泳后的凝胶立即浸泡在固定液(500 ml 乙醇,100 ml 冰醋酸,400 ml 蒸馏水)中至少30 min,如有必要可在固定液中浸泡过夜;
⑵ 将固定后的凝胶在热的染色液(0.29 g 考马斯亮蓝溶解在250 ml 脱色液中,在使用前边搅拌边加热至60℃)中浸泡10min,然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次;
⑶ 多次变换脱色液(250 ml 乙醇,80 ml冰醋酸,加蒸馏水至1 L),直至凝胶背景脱净为止,为加快脱色,可略加温度;以上各步最好用振荡器(摇床)震荡染色皿。
⑷ 为了防止凝胶干燥后的龟裂,脱去背景色的凝胶在保存液(25 ml 87% 甘油加225 ml 脱色液)中浸泡30min。
然后将凝胶放在玻璃板上,再用保存液浸湿
玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。
R250属于慢染,脱色脱的完全,G250属于快染,脱色脱的不彻底。
R250(Coomassie brilliant blue R250).C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=5 60―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点.
G250, 又名Xylene brilliant cyaninG.比考马斯亮蓝R250多二个甲基.M W=854;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.
G250中的G就是Green,偏绿,R250中的R代表Red,偏红,在进行小分子量蛋白的Tricine电泳是常用G250染色,至于加热,染和脱色都可以加热,但都是在急需知道结果的情况下采用,加热后染的背景色很重脱色时间就长而且很难将背景色脱干净,脱色液经常加热会导致固定剂的会发,很快脱色剂就没用了,脱色效果很差,而且加热挥发出来的甲醛对呼吸道有刺激作用因此尽量不要加热!
Neuhoff等介绍了一种高灵敏度的染色方法(30 ng/带),无背景色,但需要过夜。
染色液:在980 ml 2%磷酸中加100 g过硫酸铵,直到完全溶解。
再加1 g考马斯亮蓝G-250(溶在20 ml水中),不需要过滤,使用前振摇。
固定:将凝胶放在12%三氯醋酸中固定1小时。
染色:取160 ml上述染色液,在染色时加40 ml甲醇。
凝胶染色放置过夜。
染色后用0.1 M Tris-磷酸缓冲液(pH6.5)漂洗1至3分钟。
再用25%乙醇淋洗不超过1 min。
然后再10%醋酸在室温脱色2小时即可。