第二章 基因组学-2

人类基因组计划—作图
STS图谱构建的步骤
确定各STS序列及其 在基因组中的位置
基因组数据库（GDB）中至少含有 24568 个STS路标信息
插入大片段基因组文 库的构建（BAC文库）
以特定STS为标记筛 选并定位克隆
含有STS的克隆在基 因组中排序
人类基因组计划—作图
关于文库
文库的概念：含有某种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体 宿主：能容纳外源DNA片段的生物体，常用的有大肠杆菌、酵母等 载体：能携带外源DNA进入宿主细胞的工具，常用的载体有质粒载体、
基因组学（genomics）
定义为研究基因组的结构组成、时序表达模 式和功能，并提供有关生物物种及其细胞功能的 进化信息。
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基因、基因组与基因组学 基因组学包括3个丌同的亚领域
结构基因组学(structural genomics) 功能基因组学(functional genomics) 比较基因组学(comparative genomics)
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人类基因组计划-概述
HGP的技术成果:
主要体现在对人类基因组整体结构的认识， 即人类基因组遗传图、物理图、转录图、序 列图的完成，从而奠定了人类结构基因组学 基础。而人类基因图的完成，仍有大量工作 要做。
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大 纲
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基因、基因组与基因组学
人类基因组计划
HGP的概况 HGP的作图 HGP的测序 HGP的信息处理
人类基因组计划—作图
一个1000bp的DNA分子,用酶A、酶B、酶C切割，得到 如下片段（厦门大学考研试题）
• 酶A切割: • 酶B切割: • 酶C 切割: • 酶A＋B切割: • 酶B＋C切割: 75bp • 酶A ＋C切割:
1000bp 100bp、 200bp、 50bp、 75bp、
300bp、600bp 800bp 100bp、300bp、550bp 100bp、125bp、225bp、4
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基因组学及其分支
人类基因Baidu Nhomakorabea计划—作图
基因组计划四张图谱
人类基因组计划—作图
• 遗传图谱
又称为连锁图谱（linkage map）， 指基因或DNA标志在染色体上的相对位 置与遗传距离
• 物理图谱
以定位的DNA标记序列如STS作为路标， 以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的 基因组图谱。
• 转录图谱
人类基因组计划—作图
YAC (Yeast artificial chromosome)
• YAC载体: 即酵母人工染色体，具有酵母染色体的特性，以酵母细胞 为宿主，能在酵母细胞中复制。以YAC为载体，可以乘载2 Mb的大 片段DNA，是物理作图中最早利用的大片段DNA载体。 • 优点: 容量大, 插入片段可达1400 kb. • 缺点: 转化效率低； 插入子稳定性差； 嵌合克隆比例高, 达48%； 插入DNA的制备相当困难。
与“致病”基因的差异,只是同一位点上的等位基因的差异。 人与人之间基因组99，99%是相同的，差异仅万分之一，不存在优秀基因组之 说。不存在白种人基因组、黄种人基因组。人类只有一个基因组.
人类基因组计划—作图
四、转录图谱
把mRNA先分离、定位，再转录成cDNA，这就构成一张人类基因的转 录图，cDNA片段又称表达序列标签(expressed sequence tag，EST)， 因此转录图也称为表达序列图。人类基因组中仅1％～5％的DNA是编码 序列（基因）；成人各种组织中又只有约10％的基因表达为蛋白质。
的大片段DNA载体。
• 优点：单拷贝复制，丌会因重组収生嵌合； 插入DNA的 提叏简单，便于机械化操作。
细 菌 人 工 染 色 体
（BAC）
人类基因组计划—作图
每一个菌落为带有相同 外源DNA片段的单克隆
BAC克隆的筛选
Contig
“STS-PCR反 应池”方案筛 选种子克隆
特定的STS标记
相互间具有重叠片段的 BAC克隆根据STS信息组装 成contig，并定位于基因组上
人类基因组计划—作图 黏粒
• 黏粒(cosmid)又称柯斯质粒
• 是Collins J 和Hohn B 等于1978年为克隆真核DNA 大区
段构建的带有粘性末端的cos位点质粒。即含有粘性位点 的质粒重组体。cosmid来源于噬菌体和质粒DNA的整合， 所能克隆的最大外源片段的DNA为45.9Kb。
制性酶切位点、序列标签位点等）为标记,以Mb或
Kb作为图距绘制的基因组图。
物理图谱的基本原理是将每一条染色体敲碎、
分段克隆，利用重叠的方法将这些克隆头尾重叠相
连，就可以获得横跨和覆盖整条染色体的克隆群。
人类基因组计划—作图
物理作图的基本原理
• 物理图谱的本质是路标和克隆的测序
• 单一克隆或重叠克隆都不是图谱，重叠克隆的延续可以
国际“人类基因组计划”协作组 6 国 16
中心于当日 18：00（北京时间）同时宣布：
人类基因组计划“工作框架图”胜利完成
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人类基因组计划-概述
Initial sequencing and analysis of the human genome
International Human Genome Sequencing Consortium NATURE VOL 409 15 FEBRUARY 2001 860-921
酵 母 人 工 染 色 体
(YAC)
人类基因组计划—作图
BAC载体
• BAC (Bacterial artificial chromosome)即细菌人 工染色体，具有细菌染色体的特性，以细菌细胞为宿 主，能在细菌细胞中复制。以BAC为载体，可以乘载 约300kb的大片段DNA，是物理作图中目前用得最多
图谱意义
- 可以了解基因的精确位置和功能 - 可以了解不同时间不同基因的表达情况，不同组织中基因的表达情况 - 可以了解正常情况与不正常情况下基因的表达情况 - 与遗传图谱、物理图谱、序列图谱一起成为破译基因这部天书，了解生命的 真谛的基石
大 纲
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基因、基因组与基因组学
人类基因组计划
HGP的概况 HGP的作图 HGP的测序 HGP的信息处理
人类基因组计划—作图
二、物理作图
为什么要进行物理作图？ • 遗传学图谱分辨率有限 遗传学图的分辨率依赖于得 到的交换的数目。对于人类与 大多数真核生物来说，巨大数 量的后代不易获得。 • 遗传学图谱精确度有限
酿酒酵母chr3遗传图与物理图的比较
人类基因组计划—作图
物理图谱
定义：以一段已知核苷酸序列的DNA片段（限
200bp、 375bp、425bp
确定此三种限制性内切酶在此DNA分子上的位置
人类基因组计划—作图 2. 序列标记位点作图
—大基因组物理图主流构建技术
• STS图谱是最基本和最为有用的染色体物理图谱之一 • 序列标记位点（Sequence tagged site, STS） :指一段短的DNA序列, 通常长度在100-500bp,易于识别, 在待研究的染色体或基因组中仅存 有1个拷贝。因此当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这两个片 段彼此重叠。 • STS图谱就是以STS为路标（平均每100Kb一个），将DNA克隆片段有序 地定位到基因组上
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基因组学及其分支
人类基因组计划—测序
人类基因组计划的测序
测序策略
全基因组散弹法 克隆重叠群法
测序技术
第一代测序技术 第二代测序技术 第三代测序技术
人类基因组计划—测序
大规模基因组测序的两种策略
• 全基因组霰弹法
（Whole Genome Shot-gun)
• 逐步克隆法（克隆重叠群法）
（Clone by Clone）
噬菌体载体、细菌人工染色体等
作为载体的基本要求
能在宿主细胞中进行独立的复制
具有多克隆位点，可插入外源 DNA片段
有合适的筛选标记，如抗药性 大小合适，易于分离纯化 拷贝数多
人类基因组计划—作图 构建图谱的载体
载体 酵母人工染色体 细菌人工染色体 黏粒 噬菌体和质粒 可克隆DNA片段大小 100~2000kb 80~350kb 31~45kb 20kb以下
根据概率大小，人们就可以推断出同一条染色体上两点间的相对距离 和位置关系。
我们得到的这张图谱也就只能显示标记之间的相对距离。我们称这
一距离(概率)为遗传距离(cM)，由此构建的图谱也称为遗传图谱。
人类基因组计划—作图
遗传作图的DNA（分子）标记
• 第一代：限制性片段长度多态性
（restriction fragment length polymorphisms,RFLP）
利用EST（expressed sequence tags 表 达序列标签）作为标记所构建的分子遗 传图谱
• 序列图谱
通过基因组测序得到的，以A、T、G、C 为标记单位的基因组DNA序列
人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这“四张图”上
人类基因组计划—作图
一、遗传作图
定义：采用遗传学分析方法将基因或其他DNA顺序标定在
人类基因组计划—测序
染色体上构建连锁图。
遗传图谱(genetic map)又称连锁图谱(linkage map)或 遗传连锁图谱(genetic linkage map)：指基因组内基因和 专一的多态性DNA标记(marker)相对位置的图谱。
人类基因组计划—作图
遗传图距的单位：厘摩（cM）。早期绘制的经典遗传图 谱的单位是重组率，1%的重组率为1个遗传单位。现代遗传 图谱的单位为厘摩(centi Morgan，cM)，1cM相当于1%的重
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人类基因组计划-概述
The Sequence of the Human Genome
Celera Genomics
16 FEBRUARY 2001 SCIENCE VOL 291 1304-1351
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人类基因组计划-概述
人类基因组草图基本信息
• 由31.65亿bp组成
• 含3～3.5万基因
• 与蛋白质合成有关的基因占2%
人类基因组计划—作图
黏
粒
人类基因组计划—作图
三、序列图谱
以某一染色体上所含的全部碱基顺序绘制的图谱。既包 括转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和 功能未知序列的综合。
图谱意义
当前人类基因组全序列图实际上是一个“代表性人类个体”的序列图，因为所有
人类基因个体的基因位点都是相同的,不同族种、不同个体的基因差异,以及“正常”
• 第二代：简单序列长度多态性
（simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs) –小卫星序列：（Minisatellite DNA） –微卫星序列：（Microsatellite DNA, MS）
• 第三代：单核苷酸多态性标记
（single nucleotide polymorphisms,SNP）
制成图谱，克隆末端的数量决定了可排DNA片段的数量
人类基因组计划—作图
物理作图的主要环节
染色体
大分子DNA的提取
DNA
大片段DNA的克隆
作图文库
物理作图
物理图谱
人类基因组计划—作图
物理作图的方法
1. 限制酶作图
• 定义：将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 • 局限性：只能应用于相对较小的DNA分子。对于DNA 分子长度<50Kb的片段，一般没有什么困难。而对于 >50Kb的DNA分子，可选用稀有切点内切酶酶切DNA。
大 纲
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基因、基因组与基因组学
人类基因组计划
HGP的概况 HGP的作图 HGP的测序 HGP的信息处理
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基因组学及其分支
基因、基因组与基因组学
基因组（genome)
细胞或生物体所含的一套完整的单倍体遗传物质
编码蛋白的结构基因 基因组DNA 复制转录的调控序列 功能尚不清楚的区域
基因、基因组与基因组学
组率，约为1,000,000个碱基对(base pairs，bp)
交换率或交换值或重组频率= 减数分裂的重组产物\减数 分裂的总产物
人类基因组计划—作图
构建遗传图谱的基本原理
真核生物遗传过程中会发生减数分裂，此过程中染色体要进行重组 和交换，这种重组和交换的概率会随着染色体上任意两点间相对距离的
远近而发生相应的变化。
基因组学概念
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人类基因组计划-概述
人类基因组计划的研究目标
• 绘制人类基因组的高分辨遗传图谱 • 绘制人类及某些模式基因组的各种物理图谱 • 确定人类及某些模式生物的DNA全序列 • 收集、储存、传播和分析所得资料 • 发展用于此研究的一系列新技术
人类基因组计划-概述 2000年6月26日 值得载入人类自然科学史册的一个日子