细菌-酵母-霉菌的形态与菌落特征观察

实验四、细菌，酵母，霉菌的形态与菌落特征观察

一、实验目的

细菌：观察食品中常见细菌的平板菌落特征，了解细菌的菌落在细菌形态学检定上的重要性

酵母菌：1.学习并掌握观察酵母菌的形态及出芽繁殖的基本方式

2.学习区分酵母的死活细胞的实验方法

3.观察酵母的平板菌落特征，了解酵母菌的菌落在真菌形态学检定上的重要性

霉菌：1.学习并掌握观察四类常见霉菌形态特征的基本方法

2.掌握青霉，曲霉的小室栽片培养法，以便更好地观察其个体形态

3.观察霉菌的平板菌落特征，了解霉菌的菌落特征在丝状真菌形态学检定上的重要性

二、实验原理

1．细菌：将单个微生物细胞或多个同种细胞接种于固体培养基表面，经适宜条件培养，以母细胞为中心，在有限空间中大量繁殖，扩展成一堆肉眼可见的有一定形态构造的子细胞群落，成为菌落。若将某一纯种细胞大量密集接种于固体培养基表面，菌体生长的各菌落连接成片，称为菌苔。各种细菌在平板上生成的菌落均具有一定特征，对细菌的分类，鉴定有重要意义，菌落主要用于微生物的分离，纯化，鉴定，计数等研究和选种，育种等实际工作中。

2．酵母菌：以出芽繁殖为主要特征的不运动的单细胞真核微生物，其细胞核与细胞质有明显分化，个体大小比常见细菌大几倍甚至几十倍，酵母菌的形态通常有球状，卵圆状，椭圆状，柱状，或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖主要有芽殖，裂殖与产生掷孢子和厚垣孢子。有性繁殖通过结合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞在一系列的芽殖后若长大的子细胞与母细胞不分离，就会形成藕节状的假菌丝，称假丝酵母。

美蓝是一种无毒的弱氧化剂染料，其氧化型呈蓝色，还原型呈无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，故可用美蓝鉴别细胞的死活。但应注意美蓝的浓度不宜过高（一般以0.05%浓度为宜），染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。

酵母菌在固体培养基上的菌落比细菌较大而厚（凸起）。其表面光滑而湿润（有的酵母菌老龄时成干燥而皱缩状），质地柔软而黏稠，容易用接种环挑起，不透明，颜色多为乳白色或奶油色，少数为红色。菌落的颜色、光泽、质地、表面和边缘形状等特征都是酵母菌分类、鉴定的依据。

3．霉菌：有复杂的菌丝体组成，分为基内菌丝或营养菌丝，气生菌丝或繁殖菌丝，有范志菌丝产生孢子。观察霉菌的形态常有三种方法：乳酸石炭酸棉蓝浸片法、小室载玻片法、玻璃纸培养法。

乳酸石炭酸棉蓝浸片法，是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片。由于霉菌菌丝较粗大，置于水中观察时，菌丝容易收缩变形，故常用乳酸石炭酸棉蓝染色液制片使细胞不会变形，染液的蓝色能增强反差，并具有防腐、防干燥、防止孢子飞散作用。但用接种针（或小镊子）挑取菌丝体时，菌体各部分结构在制片时易被破坏，不利于观察其完整形态。

霉菌在固体培养基上生长成棉絮状（毛霉），蜘蛛网状（根霉），绒毛状（曲霉）和地毯状（青霉）的菌落。其繁殖方式多为无性繁殖和少数有性繁殖霉菌的菌丝体及其菌落形态特征是霉菌分类，鉴定的重要依据。

三、实验材料

1．菌种：大肠杆菌、酵母菌、根霉、青霉、黑曲霉。

2．试剂：0.1%美蓝染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液。

3．仪器与其他用具：光学显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、镊子。

四、实验步骤

1．细菌的菌落特征观察。

2．（1）酵母菌死活细胞的鉴别：在载玻片中央加1滴美蓝染色液，然后按无菌操作以接种环挑取少量酵母菌苔与染色液混匀，染色2~3min。染色液不宜过多或过少，否则在加盖玻片时菌液溢出或有气泡。另取一清洁盖玻片，将一边与菌液接触，以45度角缓慢覆盖菌液。将制片先用低倍镜，再用高倍镜观察，区分死细胞（蓝色）、活细胞（无色）、老龄细胞（淡蓝色）。

（2）酵母菌的菌落特征观察。

3．（1）霉菌的形态观察：乳酸石炭酸棉蓝浸片法。在载玻片上滴1滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用接种环（或镊子）从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的菌丝，置于载玻片上的染液中，小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片（勿压入气泡和移动盖玻片，以免影响观察），置于低倍镜和高倍镜下观察三类霉菌内容如下：

①根霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状、大小。

②曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。

③青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生孢子的形状等。

（2）霉菌的菌落特征观察。

五、实验结果

1．大肠杆菌的菌落特征观察：小菌落（直径1~2mm），菌落边缘整齐，圆形，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰白色。

2．（1）酵母菌死活细胞的鉴别：无色为活细胞，蓝色为死细胞。

（高倍镜下的酵母菌）

（2）酵母菌的菌落特征观察：小菌落（直径1~2mm），菌落表面光滑、湿润、粘稠，易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色一致。

3 . （1）霉菌的形态观察。

①根霉：可观察到孢子囊梗、囊轴。

（低倍镜下）

②曲霉：可观察到分生孢子梗、顶囊、分生孢子。

③青霉：可观察到分生孢子梗、小梗等。

根霉：蔓延生长，充满整个培养基，白色蜘蛛网状。

（根霉在PDA培养基上）

黑曲霉：局限生长，直径2~3cm，结构疏松，绒毛状，边缘生长稀疏，呈白色，中央部分颜色暗绿，反面白色。

（黑曲霉在孟加拉红培养基上）

青霉：局限生长，直径1cm左右，菌落绒状、厚实，中央呈浅灰绿色，反面暗黄色。

六、思考题