酵母菌的形态观察

【实验题目】

酵母菌的形态观察

【实验目的】

1.掌握酵母菌一般形态与细菌的区别

2.观察酵母菌的出芽生殖，区分酵母菌的死细胞和活细胞

3.学习酵母菌子囊孢子的观察方法

【实验器材】

1.菌种：

酿酒酵母2d麦芽汁斜面培养物

2.溶液和试剂：

A) 0.1%吕氏碱性美蓝溶液、质量分数为95%的乙醇溶液、5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水

溶液、蒸馏水

B）香柏油、二甲苯

3.仪器及其它用品：

普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）等

【实验原理】

1、单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大部分采取出芽方式进行无性繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。

2、由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般采用美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。

3、采用美蓝染液水浸法可以对酵母菌的活细胞和死细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色，由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型转变为无色的还原型，而死细胞或衰老细胞胞内还原性弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色，因此，用美兰染色后，活细胞呈无色，死细胞呈蓝色。

【实验内容及步骤】

1、酵母菌制片与简单染色--美蓝染液水浸片法

1)滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，无菌操作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物挑取少许菌体置于染液中，混合均匀。

2)用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。

3)将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活细胞。

4)染色30min后，再次观察，注意死活细胞的比例是否发生变化。

2、酵母菌子囊孢子的观察

1)涂片。先在洁净载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环无菌操作挑取适量酵母菌菌体于蒸馏水中，混合均匀。

2)干燥固定。将载玻片在酒精灯上方来回移动，注意不要让载玻片距离火焰过近，以免烫死酵母菌细胞，可用手背反复试温度。

3)染色。孔雀绿染色 1-2min；水洗后用95%的乙醇溶液脱色30s；水洗后用番红染液复染1min；水洗后干燥。

4)镜检。将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。

【实验结果】

1、酵母菌死活细胞鉴定

时间(min) 立即观察3min 30min 细胞死活情况极少数死亡部分死亡几乎全部死亡

2、酵母菌子囊孢子的观察

左图：立即观察

右图：局部放大

白色：活细胞

蓝色：死细胞染色3min后染色30min后

左图：油镜下视野

右图：局部放大

酵母菌菌体呈红色

子囊孢子呈绿色

【实验小结】

（1）酵母菌一般呈卵圆形、圆形或圆柱形。

（2）酵母菌大部分采取出芽方式进行无性繁殖，在条件恶劣的情况下进行有性繁殖，形成子囊和子囊孢子。在进行有性繁殖时，两个单倍体的营养细胞结合，质配后发生核配，形成二倍体细胞。这种二倍体细胞在许多情况下能通过出芽繁殖延续几代。在适当的条件下，二倍体细胞的核可进行减数分裂，形成子囊孢子。

（3）在本次实验中，应该注意的地方：

1、从液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶，因为长时间培养后菌体会沉积到锥形瓶底部。

2、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免损坏细胞。

3、滴加染液要适当，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。

4、盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。

【思考与讨论】

1、根据观察，吕氏碱性美蓝染液浓度及作用时间与酿酒酵母死、活细胞比例变化是否有关系？试分析原因。

答：时间越长则视野中死亡酵母菌比例越大。原因：酵母菌处于吕氏碱性美蓝染液中会导致细胞脱水死亡，时间越长，细胞死亡数量越多。

2、酿酒酵母除了通过出芽方式进行无性生殖以外，还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在实验中是否观察到了酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因。

答：观察到了。结果如上图所示。

若未观察到，原因可能为培养酵母菌的环境不够恶劣，酵母菌在条件恶劣的情况下形成子囊和子囊孢子，进行有性繁殖。或者是因为染色不够成功。

【附录】培养基配方

麦氏琼脂培养基配方

葡萄糖1g

KCL 1.8g

酵母浸膏 2.5g

醋酸钠8.2g

琼脂15-20g

蒸馏水1000ml

PH 自然113℃灭菌30min