遗传多样性的分子检测

从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种： ① 同义cSNP(synonymous cSNP),即SNP所致的编码序列的改
变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未
突变碱基的含义相同；
② 同义cSNP(non-synonymous cSNP),指碱基序列的改变可使
以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质 的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。 cSNP中约有一半为非同义cSNP。
在别的物种中使用时要进行筛选，且多在较近缘的物种间利用，
否则可信度会受影响； ②微卫星引物较贵，成本较高。
表达序列标签（EST）标记
EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测
序获得的短的cDNA 部分序列，代表一个完整基因的一小部分，
在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp 。 EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文 库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
分辨能力。
AFLP分子标记的特点
③ 可靠性好，重复性高。AFLP分析采用特定引物扩增，退火
温度高，使假阳性降低，可靠性增高。AFLP标记在后代中 的遗传和分离中遵守孟德尔定律；种群中的AFLP标记位点 遵循Hardy-Weinberg平衡。 ④ 对DNA模板质量要求高，对其浓度变化不敏感。AFLP反应 对模板浓度要求不高，在浓度相差1000倍的范围内仍可得到 基本一致的结果。但该反应对模板DNA的质量要求较为严格，
的变异称为多样性。随着孟德尔遗传定律的重新发现，摩 尔根染色体遗传学及后来发展的细胞遗传学的诞生为群体 遗传理论的发现奠定了基础并提供了科学的实验依据，充 分证实了自然界中确实存在大量的遗传变异。
随着生物学理论和技术的不断进步，以及实验条件和方
法的不断改进，检测遗传多样性的方法日益成熟和多样化，
可以从不同的角度和层次来揭示物种的变异。 遗传标记（ genetic markers ）的发展经历了形态学标记 （ morphological markers ） 、 细 胞 学 标 记 （ cytological markers ）、生物化学标记（ biochemical markers ）和分 子标记（molecular markers）4各阶段。
CG中的C 常为甲基化的,自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有
可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总
的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP，cSNP)比较少，因 为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾 病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。
随机扩增多态性DNA（RAPD）标记 RAPD技术是由Williams和Welsh领导的两个小组同 时提出的，Williams称之为RAPD，Welsh称之为APPCR。 它是利用一个随机序列的寡核苷酸引物，通常为10 个核苷酸，以基因组DNA作为模板进行PCR扩增反应， 经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。
SNP的特性 ① SNP数量多，分布广泛 ② SNP适于快速、规模化筛查 ③ SNP等位基因的频率容易估计 ④ 易于基因分型
长度多态性（AFLP）标记、简单重复序列（SSR）标记、内部
简单重复序列（ISSR）标记等； 第三类是基于测序和DAN芯片技术为基础的分子标记，如表达 序列标签（EST）标记和单核苷酸多态性（SNP）标记等。
理想的DNA分子标记应具备的特点
①遗传多样性高
②共显性遗传
③在基因组中大量存在且分布均匀 ④表现为“中性”，对目标性状表达无不良影响，与不良性状无 必然连锁 ⑤稳定性、重现性高
源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速
物种间相关信息的迅速转化。
EST作用具体表现在：
① 用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱； ② 作为探针用于放射性杂交； ③ 用于定位克隆； ④ 借以寻找新的基因； ⑤ 作为分子标记； ⑥ 用于研究生物群体多态性；
⑦ 用于研究基因的功能；
⑧ 有助于药物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ开发、品种的改良； ⑨ 促进基因芯片的发展等方面。
第三章 遗传多样性的分子检测
遗传多样性的概念
遗传多样性（genetic diversity）是生物多样性的重要组
成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础，任何物
种都有其独特的基因库或遗传组织形式。 广义的遗传多样性是指地球上所有生物携带的遗传信息 的总和，但通常所说的遗传多样性是指种内的遗传多样性， 即种内不同种群之间或一个种群内不同个体的遗传变异。
EST构建的技术路线： ① 提取样品的总RNA或带有polyA的mRNA ② 构建cDNA文库，随机挑取大量克隆进行 ③ EST测序
④ 对测得的EST进行组装、拼接
⑤ 对网上已有的EST数据库进行同源性比较 ⑥ 确定EST代表的是已知基因还是未知基因 ⑦ 对基因进行定位、结构、功能检测分析
EST的应用：
微卫星标记的基本原理：
根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增
微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用 PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶 电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR标记
优点： ①一般检测到的是一个单一的多等位基因位点； ②微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子； ③所需DNA量少。 缺点： ①微卫星引物的通用性还不够高，一个物种的特异微卫星引物
增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。
AFLP分子标记的特点
① DNA需要量少，检测效率高，理论上可产生无限多的AFLP
标记。一个0.5mg的DNA样品可做4000个反应。由于AFLP 分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择 性碱基，因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖 整个基因组。 ② 多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性 碱基的种类与数目，来调节扩增的条带数，具有较强的多态
RAPD
优点：
1)不需要了解研究对象基因组的任何序列，只需很少纯度不高的模板，就可
以检测出大量的信息。 2)无需专门设计反应引物，随机设计长度为8-10个碱基的核苷酸序列就可应
用。
3)操作简便，不涉及分子杂交、放射自显影等技术。 4)需要很少的DNA样本。
5)不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，能够客观地提示供试材料之间
单核苷酸多态性（SNP）标记
SNP全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组
上单个核苷酸的变异形成的遗传标记，其数量很多，多态性
丰富。 从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式, 但实际上发生的只有两种,即转换和颠换,二者之比为1 :2。 SNP 在CG序列上出现最为频繁,而且多是C转换为T ,原因是
EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度
保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记(如AFLP、 RAPD、SSR 等) 相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标 记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信 息是特别有用。同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来
品种、品系乃至无性系间的差异。
DNA标记的优越性
①较高的可靠性，直接以DAN的形式表现，不受环境因素、取样 部位和发育阶段的影响，不存在基因表达与否的问题； ②数量多，遍及整个基因组； ③多态性高，自然存在着许多变异； ④表现为“中性”，不影响目的基因的表达，与不良性状无必然 的连锁； ⑤有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基 因型。
⑥信息量大，分析效率高
⑦检测手段简单快捷，易于实现自动化 ⑧开发成本和使用成本低
限制性片段长度多态性（RFLP）标记
RFLP是最早发展的分子标记，用已知的限制性内切酶消化从生 物体中提取的DNA，经过电泳、印迹、探针杂交，最后用放射自
显影显色或发光分析显示与探针互补的DNA片段，因为每种限制
酶只识别专一的碱基序列，DNA序列的变化就会导致酶切位点的 减少或增加，限制性片段的长度发生变化从而显示多样性。
④ 利用AFLP技术研究基因表达与调控；
⑤ 分类和进化研究； ⑥ 甲基化研究，等。
微卫星标记
微卫星标记（microsatellite），又称为短串联重复序列
(simple tandem repeats,STRs)或简单重复序列（simple
sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单 重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单 位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫 星标记的应用非常广泛。
DNA分子标记
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。 形态学标记、细胞学标记和同工酶标记都是基因表达的结果，
是对基因的间接反映，标记数目有限、多态性差。
DNA分子标记是以个体间核苷酸序列差异为基础的遗传标记，
是DNA水平上遗传变异的直接反映，能更准确的揭示种、变种、
遗传多样性的表现层次 遗传多样性的表现形式是多层次的，可以从形 态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及 DNA序列等不同的方面来体现，其中DNA多样性 是遗传多样性的本质。
遗传多样性的研究
对遗传多样性的系统研究始于十九世纪，达尔文在《物 种起源》中用大量资料和证据揭示出生物中普遍存在的变
异现象，并发现大部分变异有遗传现象，他把这种可遗传
AFLP 是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限
制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使双 链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然 后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链 的基础上添加1-3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行
选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩
DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。
AFLP技术的应用：AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高
等优点，近年来广泛应用于遗传育种研究，在动物遗传育种、
动物基因组研究中有着广泛的应用前景，如： ① 构建遗传连锁图谱； ② 利用AFLP快速鉴别与目的基因紧密连锁的分子标记； ③ AFLP辅助的轮回选择育种；
根据重复单元的构成与分布，微卫星被分为3类：
① 单纯（pure）SSR：指由单一的重复单元所组成的序列，如
(AT) n；
② 复合（compound）SSR：是由2个或多个重复单元组成的
序列，如(GT)n(AT)m； ③ 间隔（interrupted）SSR：在重复序列中有其它核苷酸夹杂 其中，如(GT)nGG(GT)m。
DNA的差异。
RAPD
局限性： ①它呈显性遗传标记（极少数共显性），不能有效区分杂合子 和纯合子。 ②易受反应条件的影响，某些情况下，重复性较差，可靠性较
低，对反应的微小变化十分敏感。如聚合酶的来源，DNA不同
提取方法，Mg2+离子浓度等都需要严格控制。
扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检 测DNA多态性的新方法。
RFLP标记特点：呈孟德尔遗传，不受环境影响；RFLP标记等位
基因之间呈共显性；非等位的RFLP标记之间不存在上位效应及
其它形式的基因互作；结果稳定可靠，重复性好。 RFLP标记的缺点：分析程序复杂，技术难度大，费时，成本高， 需要适合的探针和放射性同位素，而且每次反应需要的DNA量较 大，多态性位点数目有限，所以应用受一定的限制。
根据依赖的技术手段的不同，DNA分子标记可分为3大类：
第一类是以杂交技术为基础的分子标记，如限制性片段长度多
态性（RFLP）标记、数目可变串联重复多态性（VNTR）标记； 第二类是基于PCR技术为基础的分子标记，如随机扩增多态性 DNA（RAPD）标记、任意RCP（AP-PCR）标记、DNA指纹 （DAF）标记、序列特征化扩增区域（SCAR）标记、扩增片段