抗体的纯化和检测详细版讲义

结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b > IgG3
> IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依
赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化
与其结合较弱的IgG1。
腹水处理 装柱 平衡 上样 洗脱
12000r，15min，去除大的凝 块
将Protein A-Sep harose CL-4B 干粉溶解, 再用p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液 浸泡 15min ,然后装入层析柱中。
采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳
层析图及电泳结果
AKTA蛋白纯化系统
AKTA主要是根据电导率的不同级盐浓度 的不同来洗脱不同的物质。系统主要分为 两部分，分别是检测系统和层析柱，根据 洗脱的不同的ph值来确定洗脱的物质是什 么。当然全自动的AKTA系统可以多柱， 多样品，多缓冲液，多组份检测，其检测 功能包括多波长紫外/可见光、电导、pH、 压力、温度、等等。功能很强大。
• Protein A
• A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特
经济
6. 生产过程无动物血清成分
CaptoAdhere
原理：Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化 而设计，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）综 合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方 式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的 去除能力；此外，通过有效的实验设计 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere 介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主 蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒。
缓冲液平衡柱子，测ph=7.4
缓冲液稀释，滤膜过滤
用ph=4.0的柠檬酸溶液洗脱抗体，再用 ph=9.0的Tris-hcl缓冲液调节至7.0。应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线 开始上升,即出现洗脱峰时,开始收集洗脱
液
平衡 电泳鉴定
至洗脱峰回到基线后，使用上样缓冲液 平衡柱子
• （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 根据样品中的蛋白质的含量以及种类的
配制饱和浓度的硫酸铵溶液来沉淀样品中的 大多数蛋白质。当然这一步也有利于后边的 层析。
样品预处理
10000r，30min 离心
保留上清液
加入饱和SAS （1:1）
搅拌过夜（4度）
出去杂质 破碎沉淀细胞
抗体在里边 盐析蛋白 充分沉淀蛋白
沉淀
弃上清 液
10000r，30min， 离心
沉淀蛋白
蛋白成分：抗体，极少 量杂蛋白，SAS
PBS溶液
溶解
叠氮钠
沉淀
离心
透析袋
3-6个小时更换一次透析 缓冲液（24-48h）
Protein A/G亲和层析
亲和层析是一种快速有效的生物活性 物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对目 的蛋白选择性的吸收和分离,可取得较 高的纯化效果,且操作简便,广泛地应用 于实验室抗体纯化。由于产品价格昂贵, 使用成本较高,限制了它的运用。
点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
• Prowk.baidu.comein G
G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表 面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于 A蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。 像A蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异 性结合，不同的是，Protein G Sepharose 还可以特异性低亲和地与重链的CH1及轻 链的Cκ 结合而用于纯化Fab 及F(ab’)2。另 外，ProteinG可以广泛、更强地结合许多 类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清
抗体 纯化的步骤
#抗体的纯化#
饱和硫酸铵沉淀法
• 饱和硫酸氨分级沉淀法是从溶液中 分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原 始，非特异性分离技术。
• 饱和硫酸氨沉淀法作为抗体纯化的第一步 ,难以得到高纯度的抗体。但是它能够浓 缩和出去大部分的蛋白质，尤其是脂蛋白
基本原理
水分子
水化膜
盐离子溶液
竞争 关系
蛋白结合水平更低，纯度更高，配体脱落 也相对更低。
重链
Protein A-Sep harose CL2-4B 亲 和层析柱分离提纯IgG
•
Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法
的原理: A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结
合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力,
Capto Adhere是一种流穿模式的纯化系统，能够将宿 主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平， 载量可达100-200mg/ml介质，单步收率>90%。此外， Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力。
两步层析工艺 将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层 析纯化。Mabselect SuRe可 以达到>99%的抗体纯度， 亲和洗脱峰使用 Captoadhere的流穿模式进 行精纯: 使抗体分子流穿而 聚集体、宿主蛋白、脱落 的蛋白A配基等杂质结合在 Adhere柱上加以去除。这 样仅用两步层析就可以得
抗体的纯化 和检测详细
版
怎么纯化我们想要的抗体？
常见单抗的结构、种类、性质
单抗特性及纯化策略
每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖 基化程度等生化性质各不相同。选择单抗 的纯化方法，既要了解他们的共性，又要 了解个性，从而制定相应的纯化策略(下 表 3)。
#抗体的纯化#
纯化步骤
#抗体的纯化#
MabSelect 系列——大规模抗体 纯化亲和层析介质
• MabSelect 是一系列最新的大规模纯化抗体 的亲和层析介质。它们的特点包括：
1. 更高的流速和动态载量 2. 更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高 3. 更低的蛋白A脱落 4. 更易于工艺的线性放大 5. MabSelect易于清洗与除菌，寿命更长、更
蛋白质溶液
强
弱
溶解度
这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。 硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变 性而被广泛应用。
2， 操作步骤
• 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的 硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所 需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用 来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50%