植物细胞工程课件 第三章 细胞克隆与种子细胞筛选
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等
4.
5. 6.
切成1mm3大小
再漂洗2-3次 转移到培养瓶内培养。
特点
直接切割分离的组织块，在一定程
度上保持了原有的组织结构，对于初期体
外培养的环境适应性比直接分离成单细胞
要强，因此，短期组织块培养成为动物细
胞培养的材料来源之一。
单层细胞培养
1. 将解离获得的细胞沉淀
平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率
是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比
例。
3.2.3 看护培养
看护培养（nurse culture）技术首先是有 Muir
等（ 1954 ）设计的，其操作方法是在固体培养基上
置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织上放
一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。 当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼
细胞工程电子课件 华 中 农 业 大 学 生 命 科 学 技 术 学 院
第三章 细胞克隆与种子细胞筛选
主要内容
细胞克隆的概念与意义 植物单细胞培养技术 动物细胞克隆技术 种子细胞筛选
3.1 细胞克隆的概念与意义
细胞系 细胞克隆 细胞株
直接从机体取材的细胞、组织或器官所做 的原代培养，进行传代培养后形成的一群生 物学特征不均一的细胞便称为细胞系 (cell line ) 。
倍 增 时 间 在 12-18h 的 细 胞 类 型 接 种 密 度 以 2×104/ml 为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度 不超过2cm为好。
3.3.2 继代培养subculture
单层细胞培养
悬浮培养
贴壁细胞再培养
非贴壁细胞培养
从原代培养物中解离细胞：
震荡法
在培养瓶中加入平衡盐溶液，轻 轻震动培养瓶，可以使贴壁疏松的细胞进 入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。
脂培养基上让其迅速生长。
3.2.4 微室培养
微室培养（micro-chamber culture）是为进行
单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运
用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的 全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。这 一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞 壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究
• 单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原 代培养。
悬浮细胞培养 适用细胞 具有非贴壁特性的细胞，如血
细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌
和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。
基本方法与植物细胞的悬浮培养相似
在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬 液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间
在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，
蛋白酶消化
用 PBS 配制 0.01-0.5% 的胰蛋 白酶消化液， 37℃处理 5-15min. ，然后洗 涤用于培养。
EDTA 溶 液 洗 涤
用 PBS 配 制 1mmoll-1d EDTA，弃去原代培养的培养液，转入EDTA 洗涤细胞，然后再用 0.25% 的胰蛋白酶消 化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。
2. 用培养液配制成需要的细胞悬液
3. 接种到培养瓶内 4. 水平放置，37℃下静止培养 5. 每隔1-2天换培养液一次 6. 培养一定时间后，细胞在培养瓶底即
形成一单细胞层。
特点
• 更换培养基容易
• 便于观察不同条件对细胞生长的影响
• 培养后期容易使用灌注技术改善营养条件
• 细胞贴附于基底质上，更容易表达产物
机械剥离
用细胞刮、细胞铲或其它工具 直接剥离原代培养物。
动物细胞的培养步骤
养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡
培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞， 然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞
团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬
浮液。
3.2.2 平板培养
所谓平板培养（plating culture）是指 将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体 培养基中进行培养的技术。
• 一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官， 然后加以整理用于培养。
动物细胞原代培养过程
培养方法
• 不同取材方法，原代细胞培养方式亦不 相同. • 一般来讲，分离获得的材料多采用组织 块培养，而通过解离获得的细胞材料多 采用单层细胞培养和悬浮培养。
组织块培养
1.
将组织剪切成碎块
2.
3.
用平衡盐溶液漂洗
上，然后将培养细胞植于其中。
3.3 动物细胞克隆技术
原代培养
继代培养
单细胞克隆
3.3.1 原代培养primary culture
取材
培养
取材
组织解离 机械分离
• 解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使 其成为分ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的细胞。常用的酶有胰蛋白酶 和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬酸 钠。
• 有限细胞系（Finite Cell Line） • 无限细胞系（Infinite Cell Line）
一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞 繁殖而来。
分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的 方法成为细胞的克隆化（cloning）。
从原代培养物或细胞系中分离单个细胞 进行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具
1. 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不
能超过 6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择
合适。
2. 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗 涤2次以后，调整密度为5×105/ml。 3. 植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份 35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平
铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。
有一定的生物学特性和遗传标记，并在继代
培养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就
称为细胞株(cell strain)。
3.2
植物单细胞培养技术
愈伤组织诱导
平板培养 看护培养 微室培养
其他改进培养技术
3.2.1 愈伤组织诱导
诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割
得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培
的优良实验体系。微室培养首先是由Jones等在1960
年设计的。
3.2.5 其他改进培养技术
Horsch 等（ 1980 ）将平板培养与饲养层培养技
术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法，该方法
是在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细
胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张 滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层
4.
5. 6.
切成1mm3大小
再漂洗2-3次 转移到培养瓶内培养。
特点
直接切割分离的组织块，在一定程
度上保持了原有的组织结构，对于初期体
外培养的环境适应性比直接分离成单细胞
要强，因此，短期组织块培养成为动物细
胞培养的材料来源之一。
单层细胞培养
1. 将解离获得的细胞沉淀
平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率
是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比
例。
3.2.3 看护培养
看护培养（nurse culture）技术首先是有 Muir
等（ 1954 ）设计的，其操作方法是在固体培养基上
置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织上放
一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上。 当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转至琼
细胞工程电子课件 华 中 农 业 大 学 生 命 科 学 技 术 学 院
第三章 细胞克隆与种子细胞筛选
主要内容
细胞克隆的概念与意义 植物单细胞培养技术 动物细胞克隆技术 种子细胞筛选
3.1 细胞克隆的概念与意义
细胞系 细胞克隆 细胞株
直接从机体取材的细胞、组织或器官所做 的原代培养，进行传代培养后形成的一群生 物学特征不均一的细胞便称为细胞系 (cell line ) 。
倍 增 时 间 在 12-18h 的 细 胞 类 型 接 种 密 度 以 2×104/ml 为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度 不超过2cm为好。
3.3.2 继代培养subculture
单层细胞培养
悬浮培养
贴壁细胞再培养
非贴壁细胞培养
从原代培养物中解离细胞：
震荡法
在培养瓶中加入平衡盐溶液，轻 轻震动培养瓶，可以使贴壁疏松的细胞进 入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。
脂培养基上让其迅速生长。
3.2.4 微室培养
微室培养（micro-chamber culture）是为进行
单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术，运
用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂的 全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。这 一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细胞 壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研究
• 单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原 代培养。
悬浮细胞培养 适用细胞 具有非贴壁特性的细胞，如血
细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌
和振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。
基本方法与植物细胞的悬浮培养相似
在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬 液。接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间
在24-48h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜，
蛋白酶消化
用 PBS 配制 0.01-0.5% 的胰蛋 白酶消化液， 37℃处理 5-15min. ，然后洗 涤用于培养。
EDTA 溶 液 洗 涤
用 PBS 配 制 1mmoll-1d EDTA，弃去原代培养的培养液，转入EDTA 洗涤细胞，然后再用 0.25% 的胰蛋白酶消 化，次法用于贴壁性极强的细胞获取。
2. 用培养液配制成需要的细胞悬液
3. 接种到培养瓶内 4. 水平放置，37℃下静止培养 5. 每隔1-2天换培养液一次 6. 培养一定时间后，细胞在培养瓶底即
形成一单细胞层。
特点
• 更换培养基容易
• 便于观察不同条件对细胞生长的影响
• 培养后期容易使用灌注技术改善营养条件
• 细胞贴附于基底质上，更容易表达产物
机械剥离
用细胞刮、细胞铲或其它工具 直接剥离原代培养物。
动物细胞的培养步骤
养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡
培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞， 然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞
团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬
浮液。
3.2.2 平板培养
所谓平板培养（plating culture）是指 将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体 培养基中进行培养的技术。
• 一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官， 然后加以整理用于培养。
动物细胞原代培养过程
培养方法
• 不同取材方法，原代细胞培养方式亦不 相同. • 一般来讲，分离获得的材料多采用组织 块培养，而通过解离获得的细胞材料多 采用单层细胞培养和悬浮培养。
组织块培养
1.
将组织剪切成碎块
2.
3.
用平衡盐溶液漂洗
上，然后将培养细胞植于其中。
3.3 动物细胞克隆技术
原代培养
继代培养
单细胞克隆
3.3.1 原代培养primary culture
取材
培养
取材
组织解离 机械分离
• 解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使 其成为分ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的细胞。常用的酶有胰蛋白酶 和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬酸 钠。
• 有限细胞系（Finite Cell Line） • 无限细胞系（Infinite Cell Line）
一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞 繁殖而来。
分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的 方法成为细胞的克隆化（cloning）。
从原代培养物或细胞系中分离单个细胞 进行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具
1. 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不
能超过 6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择
合适。
2. 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗 涤2次以后，调整密度为5×105/ml。 3. 植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4份 35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平
铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。
有一定的生物学特性和遗传标记，并在继代
培养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就
称为细胞株(cell strain)。
3.2
植物单细胞培养技术
愈伤组织诱导
平板培养 看护培养 微室培养
其他改进培养技术
3.2.1 愈伤组织诱导
诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割
得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培
的优良实验体系。微室培养首先是由Jones等在1960
年设计的。
3.2.5 其他改进培养技术
Horsch 等（ 1980 ）将平板培养与饲养层培养技
术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法，该方法
是在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细
胞平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张 滤纸形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层