DNA与蛋白质互作及定点突变
蛋白质与DNA相互作用是基因表达和细胞功能的关键机制之一
蛋白质与DNA相互作用是基因表达和细胞功能的关键机制之一细胞是生命的基本单位，在细胞内，DNA和蛋白质是两个重要的分子。
DNA携带了遗传信息，而蛋白质则是细胞内的主要工作者。
在细胞内，蛋白质与DNA相互作用，这种相互作用是细胞内生命活动的重要驱动力之一。
本文将介绍蛋白质与DNA相互作用的机制及其与基因表达和细胞功能的关系。
1. 蛋白质与DNA的相互作用蛋白质与DNA的相互作用指的是蛋白质与DNA分子之间的相互作用。
蛋白质能与DNA特定的序列结合，并在DNA上进行作用。
这种结合通常需要蛋白质上特定的结构域与DNA序列上的互补结构进行作用，包括静电相互作用、氢键、范德华力等多种作用力。
通过这些相互作用，蛋白质可以在DNA上进行定位、调控基因表达等生命活动。
2. 蛋白质与基因表达的关系基因是遗传信息的基本单位，而基因表达则是基因信息从DNA到蛋白质转化的过程。
蛋白质通过与基因特定区域的结合来调节基因表达。
这种调节包括激活基因的表达、抑制基因的表达等机制。
通过调控基因表达，细胞可以对环境变化作出反应，并进行生命活动。
3. 蛋白质与细胞功能的关系蛋白质特异性地结合在DNA上，调控基因表达，从而进一步影响细胞功能。
蛋白质与DNA的相互作用是细胞生命活动的关键机制之一。
例如，蛋白质可以结合在DNA上并调控基因，使得细胞可以进行细胞周期、代谢、分化、分裂、凋亡等多种生命活动。
4. 小结细胞内的蛋白质与DNA相互作用是生命活动的关键机制之一。
蛋白质通过与DNA特定序列结合，调节基因表达，影响细胞功能。
蛋白质与DNA相互作用的机制和调控基因表达的过程是非常复杂的，还有很多待研究的问题。
总的来说，蛋白质与DNA相互作用是生命活动的关键机制之一。
它们配合相互作用，调控基因表达，影响细胞功能，维持生命活动。
在未来的研究中，我们仍将对蛋白质与DNA相互作用的机制和调控基因表达的过程进行深入研究，希望更好地理解生命的奥秘。
DNA定点突变实验
DNA定点突变实验标签：DNA 定点突变DNA定点突变可以：（1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者DNA作用元件；（3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。
详细实验方法Dpn I法实验方法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。
设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。
)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
多点突变的原理是准备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模版），退火后全部突变引物（不超过5个）都结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成环，和单链模版组成杂和环，Dpn I消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得以转化E.coli，形成双链质粒。
资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。
得到的其他质粒是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带有1-2个不同定点突变的质粒（因为存在1-2个引物结合模版延伸形成单链环的可能）。
蛋白质与dna互作的4种方法
蛋白质与dna互作的4种方法蛋白质与DNA互作是细胞内基本的生物学过程之一，涉及多种分子机制和调节因素，并在细胞的生存、发育和功能方面发挥着至关重要的作用。
下面介绍4种常见的蛋白质与DNA互作的方法。
1. DNA结合蛋白质DNA结合蛋白质是特殊的蛋白质，它们能够通过与DNA的特定序列结合来实现一系列的生物学功能。
这种DNA结合蛋白质具有可变的DNA结合域，这些域可以根据它们所处的生物环境而发生变化，从而使它们能够识别和结合具有特定序列的DNA。
这种蛋白质与DNA 的相互作用可以发生在许多细胞生物学过程中，如DNA复制、DNA修复、DNA重组、基因表达和细胞分化等。
2. 转录因子转录因子是一类介于蛋白质和DNA之间的分子，它们能够识别和结合DNA的调节区域，并调节基因表达的过程。
这些蛋白质可与DNA序列中的高度保守的核苷酸序列结合，形成一个蛋白质-DNA复合体，从而影响基因的转录。
转录因子的结合可以促进或抑制基因的转录、调节基因表达，并且可以通过多种信号通路来影响转录的语言。
3. DNA修复酶DNA修复酶是一种与DNA复制、修复和重组相关的特殊蛋白质。
当DNA发生损伤或错误时，它们可以与DNA的断裂或缺失端点结合，修复DNA中的错误部分，从而恢复正常的基因表达和蛋白质功能。
这种蛋白质与DNA的相互作用具有高度的特异性和灵活性，这使它们能够对DNA上不同类型的故障进行处理。
4. 核糖核酸酶核糖核酸酶是一种在DNA复制、RNA合成和蛋白质合成中发挥关键作用的蛋白质。
这些蛋白质能够在DNA或RNA上识别特定的核酸序列，结合并剪切核酸的特定区域，从而影响基因表达和蛋白质合成过程。
核酸酶在细胞内的作用相当重要，能够影响RNA和蛋白质的构成与功能，从而对基因的表达和细胞的功能产生直接影响。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
(图）单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
DNA蛋白质的相互作用
DNA蛋白质的相互作用DNA蛋白质的相互作用是细胞中一种重要的生物学过程，它对于基因表达的调控和细胞功能的执行至关重要。
在细胞中，DNA通过与蛋白质相互作用来形成染色体结构，调控基因的转录和复制，以及参与细胞分裂和遗传信息的传递。
本文将详细介绍DNA与蛋白质的相互作用。
DNA与蛋白质之间的相互作用可以通过多种方式发生。
其中最重要的一种是DNA与蛋白质的直接物理结合。
这种结合通常发生在DNA序列上的特定结构或序列上，这些结构或序列称为结合位点。
结合位点通常是一段短的DNA序列，与蛋白质的特定结构域相互作用。
这种特异性结合使得蛋白质能够准确地与一些特定的DNA序列结合，并执行相应的功能。
DNA与蛋白质的直接结合可以通过多种方式实现。
其中一种常见的方式是DNA双螺旋结构与蛋白质结合。
蛋白质可以通过与DNA碱基对之间的氢键形成稳定的结合。
此外，蛋白质还可以通过其他非共价相互作用力与DNA结合，例如静电相互作用和疏水相互作用。
这些不同的相互作用力共同贡献了DNA与蛋白质的结合稳定性和特异性。
DNA与蛋白质的相互作用在许多生物学过程中起着重要的作用。
例如，转录因子是一类调控基因转录的蛋白质。
它们通过与DNA结合，识别基因的启动子区域，并调控RNA聚合酶的结合和转录的启动。
此外，在DNA复制和修复过程中，多种蛋白质与DNA相互作用，以确保DNA的稳定性和完整性。
例如，DNA融合酶能够将DNA两条链解开，以便复制和修复过程中的DNA复制和修复酶能够访问DNA。
此外，DNA与蛋白质的相互作用在染色体的结构和组织中也起着关键作用。
DNA与组蛋白相互作用以形成核小体，这是染色体的基本组织单位。
组蛋白可以通过与DNA双螺旋结构的非特异性结合来包裹DNA，并使其更加紧密地组织起来。
这种紧密的组织使得染色体在细胞核中的空间占用较少，并且有助于基因的表达和遗传信息的传递。
DNA与蛋白质的相互作用还可以通过非直接的方式发生。
例如，一些蛋白质可以与其他蛋白质结合，然后与DNA相互作用，以调控基因转录和其他细胞过程。
DNA蛋白质的相互作用
7.目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步 验证
染色质免疫沉淀分析得到的结果有很大一部 分是假阳性，需要采用其他方法验证结果的 真实性。 用PCR方法进行独立的ChIP分析、电泳迁移 率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶报 告系统最终确定目的蛋白与靶DNA序列的特 异性结合。
近年来发展起来的基因芯片（chip）染色质免疫沉淀ChIP技术 相结合(chip-ChIP)的方法
2.超声波断裂染色质
甲醛交联后的染色质对限制酶和 DnaseI高度抵抗， 因此通常使用超声波使得染色质断裂。 打断后的染色质片段的平均长度应该 在500-1000bp左右。 （可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）
3.氯化铯等密度离心纯化交联的染色质
氯化铯等密度离心可以除去未交联的蛋白质、 DNA和RNA样品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸钠， 通常在4000rpm离心72h。 离心后，用连接到蠕动泵的0.25mm毛细管从梯度 的底部分步收集染色质组分，在4℃透析过夜。
八、染色体免疫沉淀技术
Chromatin immunoprecipitation （ChIp）
1.技术介绍 在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起， 超声波将染色质打碎后， 用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复 合体。 只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀 下来
2、主要步骤及内容
凝胶阻滞试验 DNaseI足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术 核酸适体技术 生物信息学方法 蛋白质芯片技术及纳米技术
一、凝胶阻滞试验
（DNA迁移率变动试验 DNA mobility shift assay）
如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区 的精确序列。
蛋白质与DNA 互作
凝胶阻滞实验1、原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。
如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。
2、过程:1）、首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子）2）、用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点）3）、标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物4）、在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳5）、最后进行放射自显影，分析电泳结果3、实验结果的分析：a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针DNA结合的转录因子蛋白质。
4、DNA竞争实验具体做法：1）、在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA（competitor DNA），如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带；2）、如果反应体系中加入的竞争DNA并不能同探针DNA竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放射自显影图片上就会出现阻滞的条带。
5、应用：a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质；b、DNA竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；c、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；d、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
DNA蛋白质的相互作用
DNA蛋白质的相互作用DNA和蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们之间的相互作用对于细胞的正常功能至关重要。
DNA蛋白质相互作用包括DNA的包装、转录和修复，这些作用在维持细胞功能和遗传信息传递中发挥着至关重要的作用。
DNA是所有生物体中遗传信息的存储库，它是由两条互补的螺旋结构组成的双链分子。
DNA的序列信息决定了蛋白质的合成，在这个过程中DNA需要与蛋白质相互作用。
其中一个最重要的相互作用是通过DNA结合蛋白质来调控基因表达。
DNA结合蛋白质可以识别特定的DNA序列，通过与DNA相互作用来启动或阻止转录过程。
这种相互作用是基因调控的基础，它们对于维持生物体的正常发育和生理功能至关重要。
DNA和蛋白质的相互作用也涉及到DNA的包装。
DNA是一个较长的分子，在细胞中需要被紧密地包装起来，以适应细胞核的有限空间。
蛋白质通过与DNA相互作用，卷曲和折叠DNA分子，形成一种称为染色质的高度有序的结构。
这种DNA的包装状态可以影响DNA的可用性和进一步的基因表达。
例如，在转录调控中，染色质状态的变化可以决定基因是否可以被转录因子访问。
蛋白-DNA相互作用还可以调节染色质的整体结构和形态，影响DNA的复制、修复和重组。
除了上述作用之外，蛋白质还可以与DNA相互作用来修复DNA的损伤。
DNA是一个非常容易受损的分子，可以受到辐射、化学物质和其他环境因素的破坏。
为了维护细胞的遗传完整性，细胞需要能够检测和修复DNA损伤。
一些蛋白质可以识别和结合损伤的DNA位点，并招募其他修复因子来修复损伤。
这些相互作用是维持基因组的稳定性和避免遗传突变的关键因素。
另外，DNA蛋白质相互作用还可以发生在细胞分裂和减数分裂中。
在细胞分裂过程中，DNA必须进行复制和分配给两个新的细胞。
这个过程需要大量的蛋白质来协调DNA的复制和分离。
蛋白质可以通过与DNA相互作用，调控DNA复制酶的活性，确保每个新细胞都获得正确的DNA复制。
总之，DNA蛋白质的相互作用在细胞的正常功能和遗传信息传递中起着重要的作用。
DNA-蛋白质互作-原理与实验方案
DNA-蛋白质互作: 原理与实验方案引言DNA-蛋白质互作是生物学研究中的重要领域之一，它研究的是DNA和蛋白质之间的相互作用关系。
理解DNA-蛋白质互作对于揭示基因调控、疾病发生机制以及新药开发等具有重要意义。
本文将介绍DNA-蛋白质互作的原理和一种常用的实验方案。
原理DNA-蛋白质互作是指DNA分子与蛋白质分子之间的相互作用。
这种相互作用可以通过多种方式发生，包括直接结合、间接调控以及增强或抑制转录等。
DNA-蛋白质互作的原理主要涉及以下几个方面：1.DNA序列特征：DNA具有一定的序列特征，不同的序列特征可以吸引特定的蛋白质结合。
例如，某些蛋白质结合特定的启动子序列，参与基因的转录调控。
2.蛋白质结构：蛋白质通过其特定的结构域与DNA相互作用。
蛋白质可以通过DNA结合结构域与DNA序列特异性地结合，进而影响DNA的功能和结构。
3.信号传导：DNA-蛋白质相互作用可以传递信号，参与细胞内的信号传导通路。
例如，一些转录因子与DNA结合后可以激活或抑制下游的基因表达。
实验方案实验材料准备•DNA样品：从细胞提取DNA，准备含有DNA的样品。
•蛋白质样品：从细胞中提取目标蛋白质，并制备蛋白质样品。
•控制样品：用于对照组的DNA和蛋白质样品。
实验步骤步骤1：制备DNA和蛋白质样品1.从细胞中提取DNA样品：使用DNA提取试剂盒，按照说明书的指引从细胞中提取DNA样品。
使用紫外可见光光度计测定DNA浓度。
2.从细胞中提取蛋白质样品：使用蛋白质提取试剂盒，按照说明书的指引从细胞中提取蛋白质样品。
使用蛋白质质量测定试剂盒测定蛋白质浓度。
步骤2：测定DNA-蛋白质相互作用1.EMSA（电泳迁移位移实验）：根据实验设计，在含有DNA和蛋白质的反应体系中进行电泳迁移位移实验。
将DNA暴露于蛋白质样品中，使其发生结合。
利用电泳迁移技术，将反应体系中的DNA与蛋白质复合物与自由DNA分离，通过凝胶电泳将其分离并观察。
蛋白质与dna互作的4种方法
蛋白质与dna互作的4种方法蛋白质与DNA互作是生命体系中非常重要的一环，它们之间的相互作用可以影响基因表达、细胞分化和生物体的发育等多个方面。
在这篇文章中，我们将介绍蛋白质与DNA互作的四种方法。
1. DNA结合蛋白DNA结合蛋白是一类能够与DNA结合的蛋白质，它们通过与DNA 的特定序列结合来调控基因表达。
这些蛋白质可以通过直接与DNA 结合来阻止或促进转录因子的结合，从而影响基因的表达。
例如，转录因子可以通过与DNA结合来激活或抑制基因的转录，从而影响细胞的功能。
2. DNA修饰酶DNA修饰酶是一类能够修饰DNA分子的酶，它们可以通过添加或去除DNA上的化学修饰基团来影响基因表达。
例如，DNA甲基化是一种常见的DNA修饰方式，它可以通过添加甲基基团来抑制基因的转录。
DNA甲基化酶就是一种能够在DNA上添加甲基基团的酶。
3. DNA复制酶DNA复制酶是一类能够在DNA复制过程中合成新的DNA链的酶，它们可以通过与DNA分子的互作来保证DNA复制的准确性。
例如，DNA聚合酶是一种能够在DNA复制过程中合成新的DNA链的酶，它可以通过与DNA分子的互作来识别正确的碱基对，并将它们添加到新的DNA链上。
4. DNA损伤修复酶DNA损伤修复酶是一类能够修复DNA分子上的损伤的酶，它们可以通过与DNA分子的互作来识别和修复DNA上的损伤。
例如，核苷酸切除修复是一种常见的DNA修复方式，它可以通过识别和切除DNA上的损伤部位来修复DNA。
DNA损伤修复酶就是一种能够识别和修复DNA上的损伤的酶。
蛋白质与DNA互作的四种方法包括DNA结合蛋白、DNA修饰酶、DNA复制酶和DNA损伤修复酶。
这些方法在生命体系中起着非常重要的作用，它们可以影响基因表达、细胞分化和生物体的发育等多个方面。
对于生命科学的研究和应用，深入了解这些方法的原理和机制是非常重要的。
分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
足迹试验的优点
可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
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第六节
原理
研究DNA与蛋白质相互作用的方法
2.6.1 凝胶阻滞试验
又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究 DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选 作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分 子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也 就相在缩短了。所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用。
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA
测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel
切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
基因定点诱变技术与DNA和蛋白质互作及定点突变介绍51页PPT
15、机会是不守纪律的。——雨果
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
基因定点诱变技术与DNA和蛋 白质互作及定点突变介绍
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)
生物物理学方法研究DNA与蛋白质互作机制
生物物理学方法研究DNA与蛋白质互作机制DNA和蛋白质是细胞中最基本的大分子，二者通过互作发挥着许多重要生物学功能。
目前，研究名为生物物理学的跨学科学科正逐渐成为研究DNA和蛋白质互作机制的主流方法之一。
本文将从生物物理学方法的角度介绍DNA和蛋白质互作机制的研究现状，包括三维结构分析、介导作用和互作动力学等方面。
一、三维结构分析DNA和蛋白质是线性大分子，但它们的结构都是高度有序的。
其中，DNA通常以双螺旋结构存在，而蛋白质表现出丰富的折叠构形。
DNA和蛋白质之间的相互作用决定了它们的结构和功能。
生物物理学方法在研究DNA和蛋白质之间的互作时，通常采用X射线晶体学、核磁共振技术等手段，来探究它们的三维结构。
通过这些技术，我们可以获得DNA和蛋白质的高分辨率结构图像。
例如，科学家们发现，蛋白质借助一些特殊的结构域，能够定向识别和结合DNA的特异序列，以实现一些生物学功能。
二、介导作用在细胞中，蛋白质在DNA修复、转录和复制等过程中发挥着重要作用。
通过介导DNA和其他生物分子的相互作用，许多蛋白质扮演着“介导者”的角色。
在生物物理学方法的研究中，一些被称为介导因子的蛋白质被广泛采用来探究DNA和蛋白质相互作用机制。
新型的方法，如中介互作谱（MSP）、核磁共振谱等，已被用于研究这些介导因子。
通过这些方法，我们能够揭示介导因子与DNA和蛋白质之间的具体作用模式，其中包括氢键、范德华力等相互作用机制。
三、互作动力学DNA分子不仅作为一个遗传物质被复制和传递，同时还与其他生物分子发生相互作用。
在这种互作过程中，分子之间的相互作用动力学是十分重要的。
在DNA和蛋白质互作的研究中，以分子动力学为代表的互作动力学研究方法得到了广泛应用。
此方法可模拟生物分子间的相互作用状态，例如DNA在某些特定条件下与蛋白质的互作过程。
分子动力学研究能够提供非常细致的信息，例如相互作用热能、介导力等。
它为我们揭示了DNA和蛋白质之间的互作机制提供了新颖的视角和思路。
蛋白质与DNA复制相互作用及复制起始机制的研究
蛋白质与DNA复制相互作用及复制起始机制的研究细胞的生命活动离不开基因的传递和表达，而这种传递和表达的过程中，DNA 复制是非常重要的一环。
在DNA复制过程中，蛋白质和DNA之间的相互作用起着非常关键的作用。
蛋白质作为DNA复制的媒介和调控因子，能够在复制起始、加速、终止等环节中发挥作用；而DNA则作为基因的物质基础，为蛋白质提供了合适的结构平台。
本文将从蛋白质与DNA复制相互作用的角度，探讨复制的起始机制。
一、蛋白质与DNA复制相互作用的基础DNA的长链结构存在碱基对间的质子共振作用和磷酸基的静电相互作用，而这种结构很容易形成螺旋结构，从而形成了DNA双螺旋结构。
在这样的基础上，蛋白质通过不同的方式与DNA相互作用，从而促进了DNA的复制过程。
1. 通过DNA结合蛋白质的直接介导DNA复制可以分为两个主要的环节：复制起始和复制终止，而这两个环节中均涉及到蛋白质与DNA之间的相互作用。
在复制起始环节中，首先需要寻找起始序列，从而为后续DNA聚合酶的加入做好准备。
这个过程通常由一些特殊的蛋白质来完成，比如认为DNA上的一些特定序列，从而促使复制的启动。
在复制终止的环节中，一些特殊的蛋白质会识别到特定的序列，并且使得DNA链断裂，从而完成复制的终止。
2. 通过辅助蛋白质的作用DNA复制过程中，还需要一些辅助蛋白质的存在，从而辅助DNA聚合酶的工作。
这些蛋白质大多数作用在复制起始的环节中，帮助聚合酶施加必要的初始动力，从而促进聚合酶的活动。
而这些蛋白质包括Helicase、Primase等。
二、复制起始机制研究的现状复制起始机制的研究主要是集中在DNA聚合酶以及辅助蛋白质的发现和机理研究上。
1. DNA聚合酶的发现DNA聚合酶是决定DNA复制的唯一酶，其主要任务是将DNA双链拆开，并将适当的碱基补充到新合成的链中。
在DNA聚合酶的发现过程中，主要有三个类型的DNA聚合酶被发现：负责合成DNA前半段的α链、负责合成DNA后半段β链、以及负责拆开DNA链的γ链。
研究蛋白质与DNA相互作用
一、凝胶阻滞试验1.试验原理又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。
如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
2.主要步骤及内容首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。
将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。
应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。
如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。
凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。
其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。
如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。
相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。
在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。
蛋白和 DNA 相互作用驱动的基因组变化的机制和功能
蛋白和 DNA 相互作用驱动的基因组变化的机制和功能基因组是生命的基础，它所承载的遗传信息控制着生物的生长、发育和适应环境能力。
然而，基因组在不同生物中并不完全相同，即使是同一物种的不同个体也存在着一定的变异。
这一变异是由基因组内的遗传元素——DNA分子的突变和重组所引起的。
而在这一过程中，蛋白质也扮演着至关重要的角色。
本文将从“蛋白- DNA相互作用”这一角度出发，探讨基因组变异的机制和功能。
一、蛋白-DNA相互作用以蛋白质为代表的一类生物大分子在生命系统中扮演着重要的角色。
其中，与DNA相互作用的蛋白质是调节基因表达的最主要分子之一。
总的来说，蛋白质-DNA相互作用表现为以下三种形式：1. DNA结合蛋白：这类蛋白主要是与DNA的碱基对相互作用，形成DNA-蛋白复合物。
复合物中的蛋白质可以调节基因的转录、修饰甚至靶向DNA序列的修复等功能。
2. DNA修饰酶：这类酶主要是以DNA为底物，进行化学修饰。
例如，DNA甲基化与去甲基化、脱氧核糖基化等。
这些修饰对与基因表达的启动和沉默密切相关。
3. 酵素和代谢物：这类生物大分子不直接与DNA结合，而是通过特定的代谢途径和生物转化过程，将DNA作为底物进行调控。
例如，DNA重组酶和甲基转移酶等。
除此之外，蛋白质-DNA相互作用还可以表现为二级和三级结构相互作用，这些结构作用能够进一步调节DNA的构象和功能。
二、蛋白- DNA相互作用驱动的基因组变化的机制基因组在遗传信息的传递过程中，会发生多种突变和重组。
这些变化与蛋白质-DNA相互作用有着紧密的联系。
我们来分别看一下它们是如何影响基因组的变异的。
1. DNA复制和修复：复制和修复是基因组变异过程中最为常见的两类事件。
在DNA复制过程中，DNA双链被蛋白质-DNA复合物解开并拆分成两个单链，然后通过DNA聚合酶进行复制。
而在DNA中发生突变后，修复路径则由蛋白质-DNA复合物整合到修复切割酶起到指导作用。
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C 沉默子
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启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，
每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始
点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
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六）体内足迹试验
• 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色 质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢 吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基 化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA 链上的蛋白质结合区。
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七）染色质免疫沉淀实验 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay
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2.寡核苷酸引物诱变技术
• 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
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㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法
•
该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来 进行的。操作较为繁琐。
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片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 远 离
五、基因定点诱变
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定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
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点突变的技术有很多种，常见的有寡核苷 酸介导的点突变技术和PCR定点突变技术。 • ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
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染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内
分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映
结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定
与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定
基因组区域结合的蛋白质的最好方法。
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1.CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合
物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色
质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，
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2.实验过程
1）首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序 列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体 上。 2）导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报 告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵” 捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 3），转化含有“诱 饵”的酵母细胞。
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。 • 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。 5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。 Nhomakorabea21
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AD:Activation domain
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第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白 质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成
DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此
复合体，特异性地富集目的蛋白结合的
DNA 片段。
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第三步：目的片段的纯化与检测，即
经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白
质的结合情况.
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– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
• ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
• 1.盒式诱变（casette mutagenesis）
•
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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• EMSA • 还被 用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特 异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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• 原理：
• 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin） 的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测 转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能 够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子， 使报告基因得到表达。
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* 顺式作用元件
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•
如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相 结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消 化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图 片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射 性标记的条带。
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五） 甲基化干扰试验 (Methylation interference assay)
•
用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G 被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白 的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离 各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。 如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质 与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残 基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中 观察到。
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酵母单杂交的基本 原理示意图
从 拟 南 芥 cDNA 文 库 中 筛选与顺式元 件DRE结 合的 转录因子示意图。
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三）凝胶阻滞实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
• 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特 殊的凝胶电泳技术
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• 原理：
DNA-BD:Binding domain
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酵母双杂交的基本原理示意图
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二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
• 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正 电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果 此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分 子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞， 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相 应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混 合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就 说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子 相结合了。
特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过
对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与
DNA相互作用的信息。
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2.操作步骤
其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步 第一步：固定，即在活细胞状态下，用甲醛固定
蛋白质－DNA复合物，然后用化学（ 微球菌酶）
或者机械（ 超声波）的手段将其随机切断为一定
长度范围内的染色质小片段。
DNA
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– 2.引物PCR定点诱变法
• 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进 行的。
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六、DNA与蛋白质互作分析
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• 外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互 作分析。 • 主要方法有：
• • • • • 酵母杂交系统 凝胶阻滞实验 DNaseI足迹实验 甲基化干扰试验 体内足迹实验