DNA与蛋白质互作及定点突变

DNA-BD:Binding domain
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酵母双杂交的基本原理示意图
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二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选 DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基 因。
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2.寡核苷酸引物诱变技术
• 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
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㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法
•
该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来 进行的。操作较为繁琐。
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片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 远 离
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第二步：免疫沉淀，即利用目的蛋白 质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成
DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此
复合体，特异性地富集目的蛋白结合的
DNA 片段。
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第三步：目的片段的纯化与检测，即
经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白
质的结合情况.
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染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内
分析发展起来的方法，它能真实、完整地反映
结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定
与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定
基因组区域结合的蛋白质的最好方法。
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1.CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合
物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色
质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，
Байду номын сангаас– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
• ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
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㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
• 1.盒式诱变（casette mutagenesis）
•
利用一段人工合成的具有突变序列的 寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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• EMSA • 还被 用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特 异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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2.实验过程
1）首先运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序 列连接到带有酵母转录因子BD编码区的表达载体 上。 2）导入酵母细胞中使之表达带有BD的杂蛋白，与报 告基因上游的启动调控区相结合，准备作为“诱饵” 捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 3）此时，若将AD的DNA与待筛选的cDNA文库中不同 插入片段相连接，获得“猎物”载体，转化含有“诱 饵”的酵母细胞。
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酵母单杂交的基本 原理示意图
从 拟 南 芥 cDNA 文 库 中 筛选与顺式元 件DRE结 合的 转录因子示意图。
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三）凝胶阻滞实验 （electrophoretic mobility shift assay, EMSA）
• 是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特 殊的凝胶电泳技术
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• 原理：
特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过
对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与
DNA相互作用的信息。
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2.操作步骤
其操作步骤可大致分为固定、沉淀和检测三步 第一步：固定，即在活细胞状态下，用甲醛固定
蛋白质－DNA复合物，然后用化学（ 微球菌酶）
或者机械（ 超声波）的手段将其随机切断为一定
长度范围内的染色质小片段。
DNA
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– 2.引物PCR定点诱变法
• 该方法是利用三种引物，两轮PCR反应来进 行的。
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六、DNA与蛋白质互作分析
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• 外源基因的功能分析涉及蛋白质与DNA的互 作分析。 • 主要方法有：
• • • • • 酵母杂交系统 凝胶阻滞实验 DNaseI足迹实验 甲基化干扰试验 体内足迹实验
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•
如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相 结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消 化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图 片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射 性标记的条带。
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五） 甲基化干扰试验 (Methylation interference assay)
•
用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G 被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白 的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离 各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。 如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质 与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残 基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中 观察到。
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六）体内足迹试验
• 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色 质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢 吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基 化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA 链上的蛋白质结合区。
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七）染色质免疫沉淀实验 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay
• 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正 电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果 此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分 子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞， 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相 应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混 合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就 说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子 相结合了。
真核生物DNA序列（非编码序列）和被 转录的结构基因距离较近，和转录调控有关。 A 启动子（启动子上游近侧序列） B 增强子
C 沉默子
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启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，
每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始
点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
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• 原理：
• 将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin） 的上游，把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测 转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（AD） 融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能 够与顺式作用元件相结合，就能激活 Pmin启动子， 使报告基因得到表达。
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* 顺式作用元件
五、基因定点诱变
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定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
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点突变的技术有很多种，常见的有寡核苷 酸介导的点突变技术和PCR定点突变技术。 • ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。 • 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。 5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain