干细胞治疗糖尿病足的机制和疗效

ｍｅｓｅ和多向分化潜能，可以分化成为脂肪细 胞、软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞等。不同类型的 干细胞形态不同，ＭＳＣｓ的形态类似成纤维细胞，呈纺 锤形；而ＣＤ３４＋ＭＮＣｓ呈圆形或类圆形，且大小不 一［２１。 １．２干细胞的特异性标志 ＥＳＣｓ特异性标志包括碱性磷酸酶活性，Ｏｃｔ一４，周 期特异性胚胎抗原，ＳＯＸ一２和ＦＯＸＤ３［３３；ＭＳＣｓ可表 达ＣＤｌ３，ＣＤ２９，ＣＤ９０，ＣＤ４４，ＣＤｌ０５，ＣＤ７１，ＣＤ７３， ＣＤｌ６６和Ｉ类主要组织相容复合物（ｍａｊｏｒ
ＭＣＨ，造血细胞标志ＣＤｌ４，ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＣＤ３３， ＣＤｌｌ７，ＣＤ８６和内皮细胞标志ＣＤ３１［４。８１；ＣＤ３４＋ ＭＮＣｓ表达造血细胞标志ＣＤ３４［９１１｜。
带血与免疫磁珠Ｍ一４５０ ＣＤ３４混合培养，ＣＤ３４十 ＭＮＣｓ与磁珠结合形成玫瑰形复合物。用ＤＹＮＡＬ 磁性粒子集中器（ＤＹＮＡＬ—ＭＰＣ）提取出玫瑰形复合
１．１
ＢＭＭＳＣｓ）：用密度梯度离心器分离出骨髓中ＭＮＣｓ 并进行培养，培养第１天，弃去不贴壁细胞，清洗留下 的贴壁细胞继续培养，待出现７０％～８０％的细胞融合 后，将细胞悬浮于胰蛋白酶－ＥＤＴＡ中，并将密度调整 为约４０００个细胞／ｃｍ２继续培养。细胞每（４～５）ｄ传 代１次，当达到预计细胞数目后，将其彻底清洗并悬浮 于生理盐水中可应用嘲。但Ｋｕｏ等［７］在制备过程中， 弃去贴壁细胞，用同样的方法培养不贴壁细胞以获得 ＭＳＣｓ。②脂肪来源的间充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ
ｏｘｙｇｅｎ
达蛋白——角质细胞特异性蛋白和细胞角蛋白，提示
ＡＭＭｓ可在修复过程中分化为上皮细胞［６］。另外， ＭＳＣｓ还能分化成内皮细胞ｎ３｜。ＣＤ３４＋干细胞也可以 分化为成熟的内皮细胞［１胡；并能促进内皮祖细胞迁移 到缺血区Ｌｌ…。 ３疗效观察及比较 现有关动物实验及临床研究均表明，各种类型的 干细胞均具有良好的疗效。 ３．１干细胞的应用方式 治疗糖尿病足的相关研究中，干细胞主要有两种 应用方式：局部注射（肌肉或皮下注射）和动脉输注。 以下列举几种应用方式。动物实验：①在伤口处局部 注射ＣＤ３４＋ＭＮＣｓ，每只小鼠干细胞用量为０．５×
ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，
ｃｅｌｌｓ，ＥＳＣｓ），间充质干细胞 ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）和ＣＤ３４＋单核细胞
（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ （ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ
ｃｅｌｌｓ，ＭＮＣｓ）。笔者就以上干细胞的基
本特性、组织修复机制、治疗效果及安全性概述如下。
ｌ
基本特性 干细胞的分化潜能和形态 干细胞是一种未分化或未充分分化的细胞，具有
ｂｒａｃｈｉａｌ ｉｎｄｅｘ，ＴＢＩ）和Ｔｃｐ０２
等‘１８］。另外，增加ＢＭＭＳＣｓ应用次数能缩短愈合时 间［应用２次：（５．２±０．７５）周与应用１次：（６．６± １．１３）周；Ｐ一０．０２６］瞳］。而且，经粒细胞集落刺激因 子刺激后，骨髓单核细胞（ｂｏｎｅ
ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ
ｃｅｌｌｓ，ＢＭＭＮＣｓ）的疗效加强［１引。经动脉应用干细胞
ｐｒｅｓｓｕｒｅ，Ｔｃｐ０２）由
（３３±１４）ｍｍＨｇ（１ ｍｍＨｇ＝０．１３３ ｋＰａ）提高到（４４±
１０）ｍｍＨｇ（Ｐ一０．０００１），６
ｒａｉｎ步行距离由（２８０±
８２）ｍ增至（３３８±９８）ｍ（Ｐ＝０．０００１），疼痛评分由 （８．２±１．３）分减至（５．６３±１．６）分（Ｐ一０．００１），并且 下肢溃疡率由４５％（９／２０）降至１５％（３／２０）（Ｐ一 ０．０３１）［１７］。而且，ＭＮＣｓ能对ＦｏｎｔａｉｎｅⅣ期糖尿病足 患者亦有效，使其保肢率达８１％（３０／３７），且明显改善 其足肱指数（Ｔｏｅ
万方数据
Ｉｎｔ
Ｊ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｈｅｍａｔｏｌ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｖ０１．３６，Ｎｏ．５
同样有良好疗效，在膝以下严重动脉缺血的糖尿病患 者中经动脉注射ＢＭＭＮＣｓ（１００～４００）×１０６，１２个月 后，Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ—Ｂｅｃｋｅｒ分级、德克萨斯州大学糖尿病 疼痛评分及ＡＢＩ均获得明显改善。经影像学分析，治 疗３个月后，干细胞注射处下游血管明显增多，新生血 管密度及长度均增加且分支增多。并且血管的再生情 况与临床症状的缓解相一致。但是，经治疗后死亡率 没有下降∽ｊ。 ３．３疗效比较 ３．３．１羊膜来源的问充质干细胞和脂肪来源的间充 质干细胞Ｋｉｍ等［４１研究发现，ＡＭＭｓ中ＩＧＦ－１的表 达量是ＡＤＭＳＣｓ的２７倍，ＥＧＦ和ＩＬ８的表达量亦更 高；同样，在成纤维细胞和内皮细胞的划痕实验中， ＡＭＭｓ组的愈合速度更快；且通过荧光标志和免疫标 志发现ＡＭＭｓ移植存活率和分化率比ＡＤＭＳＣｓ高。 动物实验表明，ＡＭＭｓ组和ＡＤＭＳＣｓ组在第７，１０， １４天的愈合速度分别为（５７．５±３．１）％与（４０．１± ２．２）％，（７４．５±２．０）％与（６０．２±２．１）％和（８７．０± ２．３）％与（７４．３士３．３）％（Ｐ均＜０．０５，ｎ一６），提示 ＡＭＭｓ组织修复能力强于ＡＤＭＳＣｓ。再者，ＡＭＭｓ 来源废弃的胎盘中，很少引起伦理学争议，将来可更广 泛的用于临床研究及治疗［４］。 ３．３．２骨髓来源的问充质干细胞和骨髓来源的单核 细胞Ｌｕ等口１研究发现，在正常及低氧分压条件下， ＢＭＭＳＣｓ中ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ和血管生成素一１的表达量 为ＢＭＭＮＣｓ的２倍以上。在Ｌｕ等［２１双盲、随机、对 照临床试验中，人组４１例伴双侧严重肢端缺血和足部 溃疡的２型糖尿病患者，肌肉注射干细胞，６周后， ＢＭＭＳＣ组的溃疡愈合率明显高于ＢＭＭＮＣ组（１０／ １１与５／１１，Ｐ一０．０２２），并提前４周（第８～１２周）达 １００％愈合率。在肢端灌注（并行血管明显增加例数： １５／１８与８／１９，Ｐ一０．００８），无痛行走时间为（３．２± １．０）与（２．６±０．９）ｒａｉｎ（Ｐ＝０．０４０），ＡＢＩ为０．１７± ０．０６与０．１２±０．０６（Ｐ＝０．０１７），Ｔｅｐ０２为（２４．４４－＿ ７．６）与（１６．４±６．４），Ｐ一０．００１）和磁共振血管成像结 果（１．９±０．５）与（１．５±０．６），（Ｐ＝０．０１８）方面， ＢＭＭＳＣｓ均优于ＢＭＭＮＣｓ。与空白对照相比，两组 均能改善静息痛缓解、降低截肢率，但两组无统计学差 异（静息痛：１．４±１．０与１．４±０．９，Ｐ一０．８１３；截肢率 均为Ｏ）Ｌ２Ｊ。 ３．３．３骨髓来源的单核细胞和外周血来源的单核细 胞在改善ＡＢＩ，表皮温度和静息痛方面，Ｇ－ＣＳＦ动 员ＰＭＭＮＣｓ疗效优于ＢＭＭＮＣｓ。但是，经Ｃ－ＣＳＦ动 员的ＢＭＭＮＣｓ在比经Ｇ—ＣＳＦ动员的ＰＢＭＮＣｓ临床 疗效更好，促使损伤组织中血管性血友病因子（ｖｏｎ
ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ
ｃｅｌｌｓ，ＡＤＭＳＣｓ）：清洗、斩碎并经
胶原酶Ｉ处理（３７℃，３ ｈ）脂肪，将其置入培养液，过滤 后以１５００ ｒｐｍ的速度离心５ ｍｉｎ。将沉淀物重新置于 培养液中，使细胞数目达到１０４／ｍＬ即可［８］。 １．４．２单个核细胞的制备 ①免疫磁珠法首先将脐
ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ），极少表达Ⅱ类
・综述・
干细胞治疗糖尿病足的机制和疗效
于靖宜
综述黄平平
审校
【摘要】糖尿病足是糖尿病常见并发症，采用有效的治疗措施对提高糖尿病患者的生活质量有重要意 义。近年研究表明，干细胞治疗糖尿病足疗效较好，笔者介绍了用于治疗糖尿病足的干细胞的基本特性、组 织修复机制及疗效。 【关键词】干细胞； 糖尿病足； 细胞因子类
ＣＤ３４＋ＭＮＣｓ占一定比例‘９｜。 ２组织修复机制 应用干细胞后，干细胞能被募集到伤口区，进而分 泌细胞因子或通过自身分化来促进组织修复。其中， 干细胞分泌的细胞因子能够促进组织再生、抑制炎症 反应及抑制细胞凋亡。 ２．１募集 将干细胞局部注射到伤口处，通过免疫荧光发现 干细胞聚集在注射处并逐渐向周围的肉芽组织扩散， 以进行下一步的组织修复口］。 ２．２分泌细胞因子 干细胞在组织修复边缘区，通过分泌或促进周围 细胞分泌上皮生长因子，血管内皮生长因子，碱性成纤 维细胞生长因子，胰岛素生长因子一１，成纤维因子，血 细胞生长因子，黏连蛋白，ＩＬ８，ＩＬ６，ＴＮＦ一８，ＴＮＦＲＩ， Ｌｅｐｔｉｎ和血管蛋白一１等［２’４’“８｜。这些细胞因子作用于 信号调节通路，激活成纤维细胞∞１和内皮细胞［４－５］，促 进其增殖及表达更多的ＥＧＦ和ＶＥＧＦ，使血管再生、 组织重塑、胶原沉积口１和基底膜基质［４１等结构再生，从 而伤口组织再生。另外，细胞因子能抑制伤口处的炎 症反应‘２’８１，进而加速伤口愈合。Ｓｈｅｎ等［１２１发现， ＣＤ３４＋ＭＮＣｓ分化过程中形成ＥＰＣ通过分泌细胞因 子ＨＩＦ—ａ和ＩＬ８，可抑制促凋亡蛋白Ｂａｘ和ＰＵＭＡ的 表达，同时增加抗凋亡蛋白Ｂｃｌ—Ｘ和Ｂｃｌ一２的表达，从 而起到抑制凋亡的作用［１ ２】。
ｉｎｄｅｘ，ＡＢＩ）
自身分化 干细胞本身具有分化潜能，目前研究发现，在伤Ｅｌ
修复中干细胞主要分化为上皮细胞和内皮细胞。羊膜 来源的间充质干细胞（ａｍｎｉｏｔｉｃ
ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ，ＡＭＭｓ）可在伤口区表达上皮细胞的特异性表
由０．６８±０．２４上升至０．８７±０．２４（Ｐ＝０．００１），经皮 氧分压（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ
２．３
１０６［１１｜。②在伤口边缘选取８个位置，每处皮下注射 １×１０７的ＭＳＣｓ［７］。临床试验：①局部应用在患肢选 ２０处注射点，每处间隔３
ｅｍ×３
ｃｍ，肌肉注射（０．５～
１．Ｏ）ｍＬ干细胞悬液，注射深度（１．０～１．５）ｃｍ；再在 每处足部溃疡基底部或周围的皮下组织注射２ ｍＬ细 胞悬液［２］。肌肉注射的深度也可为４ ｅｍ［１引。也可在 伤口边缘肌肉注射干细胞，剂量因伤口面积而定，每平 方厘米伤口面积干细胞剂量＞１×１０６Ｄ６］。②动脉注 射将前端带有球囊的导管经股动脉处进入闭塞的血 管的近心端，通常在股动脉末端或膝后窝处。到达此 处后扩张球囊暂时阻断血流，将干细胞缓慢输入（持续
ＤｏＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１９Ｘ．２０１３．０５．０２２