双向凝胶电泳
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
双向凝胶电泳实验方法
双向凝胶电泳实验方法实验方案1.样品制备(Sample preparation)1.1仪器高速离心机1.2试剂NS(制备好的);Citrated human plasma ;溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base) 1.3样品处理方法1).吸取适量的制备好的NS加入到Citrated human plasma 中，在温度为37°下孵化5min。
NS与血浆的加入比例为0.6:8ml。
2)孵化后，将样品高速离心，离心转速为，时间为。
3)除去上清液，将沉淀的纳米球再混悬于0.05M，pH7.4的磷酸缓冲盐中，再次以上次条件离心，本步骤重复三次。
4)将离心后收集到的总蛋白溶解于溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)。
2.第一相等电聚焦(IEF)2.1固定化 pH 剃度胶条的水化(IPG strip rehydration) 2.1.1仪器IPGphor2.1.2试剂水化液(8 M 尿素，2 % CHAPS，15 mM DTT 和 0.5 % IPG 缓冲液) 水化液需当天新鲜配制2.1.3实验步骤A. 加样品溶涨1).用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4 , CHAPS，2 , IPG 缓冲液，40 mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品。
蛋白质上样浓度(Q:如何确定上样浓度,)不要超过 10 mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
2).吸取适量(见下表1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
表1 IPG胶条所需水化液体积3).去掉 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG 胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条。
简述双向电泳的原理
简述双向电泳的原理
双向电泳是一种在凝胶电泳中使用的技术，用于分离和分析DNA、RNA、蛋白质等生物分子。
其原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，以便在凝胶中获得更好的分离效果。
在双向电泳中，首先在一个方向上施加电场，使待分离的生物分子向一个方向移动。
然后，改变电场的方向，使其在另一个方向上移动。
这样，生物分子会在两个方向上进行移动，从而实现更好的分离效果。
双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和电泳技术。
在凝胶电泳中，待分离的生物分子会在凝胶矩阵中随着电场的作用而移动，根据其大小和电荷的不同而被分离开来。
而双向电泳则是在凝胶电泳的基础上，通过改变电场的方向，使生物分子在两个方向上移动，以获得更好的分离效果。
双向电泳在生物分子分离和分析中具有重要的应用，尤其在蛋白质分离和分析中，可以帮助科研人员更准确地分离和鉴定不同的蛋白质。
通过掌握双向电泳的原理和技术，科研人员可以更好地开展生物分子研究，为生命科学领域的发展做出贡献。
总之，双向电泳的原理是利用两个方向的电场来推动待分离的生物分子，在凝胶中实现更好的分离效果，具有重要的生物分子分离和分析应用。
双向凝胶电泳原理(一)
双向凝胶电泳原理(一)双向凝胶电泳什么是双向凝胶电泳双向凝胶电泳，英文名字为Bisulfite-Sequencing PCR，缩写为BSP，是一种检测DNA甲基化的方法。
双向凝胶电泳主要是将DNA进行酶切、连接、甲基化等处理，然后采用PCR扩增方法得到一组产物，经过电泳反应，通过测量DNA片段长度的差异和带的强度来检测DNA的甲基化状态。
双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳的原理是利用亲核性亚硫酸酯对甲基化的DNA进行转化，通过反应后将DNA分成两条互补链，在两条链上分别添加标记，如磷酸酯和辣根过氧化物酶等。
其中，磷酸酯标记的DNA是单链的，而辣根过氧化物酶标记的DNA是双链的，可以通过电泳移动。
在电泳过程中，根据DNA带的大小和强度，判断DNA片段的长度和甲基化状态。
双向凝胶电泳的步骤双向凝胶电泳需要进行以下五个步骤：1.DNA甲基化转化：将DNA处理为亲核性亚硫酸酯，反应生成甲磺酰脲基化的DNA片段。
2.PCR扩增：将转化后的DNA进行PCR扩增，得到一组产物。
3.芯片制备：将PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后将DNA嵌入在聚合物芯片上。
4.双向标记：在两个DNA链上分别添加辣根过氧化物酶和磷酸酯等标记。
5.双向凝胶电泳：将DNA芯片通过电泳反应，根据DNA带的大小和强度，判断甲基化的DNA状态。
双向凝胶电泳的应用双向凝胶电泳主要应用于检测DNA甲基化状态、遗传疾病、肿瘤等方面。
在癌症研究中，双向凝胶电泳可以检测癌细胞的DNA甲基化状态，有助于癌症的早期诊断、治疗以及预测复发等方面。
此外，双向凝胶电泳还可以应用于基因组学、生物研究、医学科研等方面。
总结双向凝胶电泳是一种检测DNA甲基化状态的方法，通过亲核性亚硫酸酯对DNA进行转化，采用PCR扩增方法得到产物，再通过电泳反应来判断DNA片段的长度和甲基化状态。
双向凝胶电泳在生物研究、医学科研和癌症研究方面的应用非常广泛，未来也将是一个热门的研究方向。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种采用两个方向的电场同时作用于凝胶电泳系统的技术，用于分离复杂样品中的蛋白质或核酸。
首先，将样品溶解于含有凝胶的电泳缓冲液中。
凝胶是一种聚合物网状结构，可以限制分子的运动，将其分离。
常见的凝胶材料包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
第一步是水平电泳。
在水平电泳阶段，一个方向的电场施加在凝胶中，使得带电分子向着相应的电极方向移动。
这个方向通常被称为水平方向，因为它从一个电极移动到另一个电极。
在水平电泳过程中，由于分子的大小和电荷不同，它们将以不同的速度在凝胶中运动。
大分子移动缓慢，小分子移动快速。
这样，分子根据大小按照一定的顺序移动，导致它们在凝胶中排列成一条通常是呈斜角的直线。
这个方向通常被称为水平电泳通道。
第二步是垂直电泳。
在水平电泳结束后，垂直电场被施加在凝胶中，使分子以另一个方向移动。
这个方向通常被称为垂直电泳通道。
在垂直电泳过程中，分子将根据它们的电荷大小被拖曳向上（正电流）或向下（负电流）。
正电流将使分子向上移动，而负电流将使分子向下移动。
这样，分子将根据其电荷被分离并在凝胶中形成一条平行于水平电泳通道的直线。
最终，两个方向的电泳都完成后，在凝胶上会形成一个类似网格的结构，其中分子被分离成不同的带状。
这些带状物可以被染料或放射性示踪剂探测出来，从而确定分离出的分子的位置。
总结起来，双向电泳是一种利用两个方向的电场移动分子的方法。
通过水平电泳和垂直电泳，分子根据其大小和电荷被分离成不同的带状，从而实现复杂样品中蛋白质或核酸的分离和分析。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用
蛋白质双向凝胶电泳原理及应用一、双向凝胶电泳（2-DE）的原理双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；第二向则按分子量的差异用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶进行分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
二、关键参数分辨率和可重复性。
目前，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点。
采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的、可以随意精确设定的pH梯度。
建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对意向区域在pH范围内做第二轮分析，从而大大提高分辨率，威斯腾生物实验中心对这方面的研究比较全面和成熟。
灵敏度。
双向凝胶电泳灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的是用同位素标记，20ppm的标记蛋白可通过其荧光或磷光的强度而测定。
双向凝胶电泳用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即“参考胶图谱”。
三、蛋白质组研究的主要困难对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量分析。
双向凝胶电泳最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。
四、蛋白质的翻译后修饰和加工指在肽链合成完成后进行的化学反应，如磷酸化、羟基化、糖基化、二硫键形成等，可能有一百种以上。
双向凝胶电泳翻译后修饰和加工对蛋白质的正常生理功能是必需的，它们的变化往往和疾病的发生有关。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法。
成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离，是目前唯一的同时能分离成百上千种蛋白质的工具。
通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描，用相关软件（PDQUEST等）进行图谱差异分析，找到差别点。
然后把差别点切出，进行脱色、酶解。
最后样品进入质谱测试，得到质谱原始数据文件。
通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。
原理：
1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件对电泳图象进行分析。
样品要求：
1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M尿素/4%CHAPS/40mMTris（Base）/65mM DTT；
2、样品浓度大于2ug/ul；
由于蛋白质组学涉及的样品范围很广，对于具体样品的要求请和项目经理联系。
仪器：
1st dimension:第一项
IEF:IPG-PhorII(GE)and Protean IEF(BioRad) Bio-Rad Model111Mini IEF Cell
2nd dimension:第二项
GE Ruby SE600(16x16cm)
GE Ettan DALTsix(26x20cm)
BioRad Criterion pre-cast(13x9cm)
BioRad Protean(8.6x7cm)
2D凝胶图像识别软件
Image master2D Elite®
实例分析。
双向凝胶电泳的原理
双向凝胶电泳的原理双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理基于电泳的原理和凝胶电泳的原理。
电泳原理：电泳是利用物质在电场中的带电性质而产生的运动现象。
在电场中，带电的分子或离子会受到电场力的作用而向相对带电性质相反的极移动。
电泳实验中，通常使用平行的电极极板，形成一个电场，分子或离子会在电场中进行迁移和分离。
凝胶电泳原理：凝胶电泳是在分离过程中使用凝胶作为介质，使得被分离物质在凝胶中进行迁移和分离。
凝胶是具有三维网状结构的聚合物或芯粒，可以提供一定的分子筛效应，使得分子按照大小逐渐沉积。
分子越大，迁移速度越慢，分离效果越好。
双向凝胶电泳原理：双向凝胶电泳是在凝胶电泳的基础上，通过在电泳过程中改变电场方向，实现不同方向上的分离。
通常情况下，第一维电泳是水平电场电泳，第二维电泳是垂直电场电泳。
具体步骤如下：1. 首先，将样品加入到凝胶电泳样品槽内，通常是在蛋白质样品中加入还原剂和样品缓冲液，使其在电泳过程中具有一定的带电性质。
2. 准备两个平行的平板凝胶，其中一个用于第一维电泳，另一个用于第二维电泳。
凝胶通常是聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖双层凝胶。
第一维电泳凝胶的方向通常是水平的，第二维电泳凝胶的方向通常时垂直的。
3. 将第一维电泳凝胶浸泡在浸泡液中，然后将电泳样品加入到凝胶中定位。
开启电源，施加电场使样品在凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
可以根据需要调整电场的强度和时间。
4. 当第一维电泳结束后，将凝胶取出并固定，然后将其放入第二维电泳凝胶中。
将电泳样品加入到第一维凝胶的上方定位。
5. 开启电源，施加电场使样品在第二维凝胶中迁移并分离，直至达到预期的分离效果。
6. 最终，根据分子的大小和电荷，样品中的蛋白质会在凝胶中形成一系列分离带，可以通过染色等方法观察和分析分离结果。
通过双向凝胶电泳，可以实现对复杂混合物中的蛋白质的分离和分析，便于进一步的研究和应用。
双向电泳的基本原理
双向电泳的基本原理
双向电泳是蛋白质组学研究中最重要的技术，在蛋白质组学研究中发挥了重要作用。
其基本原理是：样品中含有两种或两种以上不同分子量的蛋白质，它们的分子量分布不同，在加有等电聚焦（IEF）等电聚焦缓冲液的一台凝胶电泳仪（如UMEACO）上，蛋白质分子按其大小和分子量进行分离，并可在不同的pH 范围内进行电泳。
由于等电聚焦缓冲液具有强的选择性，不同分子量的蛋白质在同一胶上得到分离，经凝胶染色后在垂直于凝胶的方向上能显示出清晰的条带。
蛋白质分子量大的向小的方向移动，分子量小的向大的方向移动。
每一条带就是一个独立的分子。
双向电泳技术可以大大缩短实验时间、降低实验成本、提高分析效率。
例如：已知蛋白序列为a/b/c，对某一蛋白进行研究，只需分离出a/b/c三条带，再经双向电泳技术分离后即可得到含有三条带的蛋白质条带。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中最重要的技术之一，其基本原理是：将样品制备成胶后，在垂直于凝胶电泳方向上将蛋白进行分离。
—— 1 —1 —。
《双向凝胶电泳 》课件
双向凝胶电泳的原理
等电聚焦
在第一向电泳中，蛋白质根据其等电点进行分离，聚焦在相应的pH区域。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在第二向电泳中，已经分离的蛋白质加入SDS（十二烷基硫酸钠）后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大 小进行分离。
生物标志物发现
通过双向凝胶电泳技术寻 找新的生物标志物，用于 疾病预警、监测和治疗。
药物研发
利用双向凝胶电泳技术分 析药物作用机制和靶点蛋 白质，为新药研发提供支 持。
研究展望
蛋白质组学研究
随着蛋白质组学研究的深入，双 向凝胶电泳技术有望在更广泛的 领域发挥重要作用。
跨学科合作
加强与其他学科领域的合作，共 同推动双向凝胶电泳技术的发展 和应用。
样品上样
将处理好的蛋白质样品上样到第一向 等电聚焦凝胶中。
等电聚焦
在第一向等电聚焦凝胶中进行等电聚 焦，分离蛋白质。
固相pH梯度第二向分离
将第一向分离后的蛋白质从凝胶中转 移到第二向SDS-PAGE凝胶中进行第 二向分离。
图像分析
染色与脱色
01
对第二向分离后的凝胶进行染色和脱色，以便观察和检测蛋白
研究疾病的发生和发展机制，为疾病的诊断和治疗提供依据。
03
生物标志物发现
利用双向凝胶电泳技术可以发现与疾病相关的生物标志物，如肿瘤标志
物、感染性疾病相关蛋白等，有助于疾病的早期诊断和预后评估。
在医学研究中的应用
1 2 3
药物作用机制研究
通过双向凝胶电泳技术分析药物作用前后蛋白质 表达谱的变化，有助于揭示药物的作用机制和靶 点。
数据共享和分析
质谱鉴定双向电泳蛋白
百泰派克生物科技质谱鉴定双向电泳蛋白双向电泳即双向凝胶电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，以实现更精确的鉴定。
百泰派克生物科技提供双向电泳获得的兴趣蛋白的质谱鉴定服务。
双向电泳双向电泳（two-dimensional electrophoresis），也称作双向凝胶电泳（Two-dimensional gel electrophoresis）或二维凝胶电泳，缩写为2-DE或2-D电泳，是凝胶电泳的一种形式，通常用于分析蛋白质。
双向电泳是等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）和SDS-PAGE的结合。
蛋白质混合物在二维凝胶上，首先根据pH值对蛋白质进行等电聚集电泳分离，之后根据蛋白质分子大小进行SDS-PAGE分离。
双向电泳完成后，将凝胶进行染色即可得到一个蛋白质二维分布图。
常用的染色技术有考马斯亮蓝染色、银染、负染和荧光染色。
双向电泳中，通过在电泳时在一条泳道上添加已知相对分子质量的一系列标准蛋白质，可以对样品中的蛋白质的相对分子质量进行估算。
质谱鉴定双向电泳蛋白通过双向电泳将样品中的蛋白质进行分离检测后，可以选取感兴趣的目标蛋白进行质谱鉴定，从而实现目标蛋白的精确鉴定。
对于Coomassie Blue，SYPRO Ruby以及Silver stain染色的样品，均可通过质谱进行蛋白的鉴定。
但是，银染的样品有可能会与质谱分析不兼容，推荐使用以下产品或者实验步骤进行银染实验：ProteoSilver Plus, Sigma (Product # PROTSIL1 or PROTSIL2)；Dodeca Silver Stain, BioRad (Product # 161-0481 or 161-0480)。
此外，用于质谱鉴定的银染样品不要进行脱色处理。
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳特点
双向凝胶电泳是一种常用的蛋白质或核酸分析技术，其特点如下：
1. 高分辨率：双向凝胶电泳可以提供较高的分辨率，允许分离几乎相同大小的DNA片段或蛋白质，使其成为分析样品组成和结构的有力工具。
2. 分离适应性强：双向凝胶电泳适用于各种样品类型，包括DNA、RNA和蛋白质等，可以进行定性和定量分析。
3. 定量准确性：通过比较样品与标准曲线，双向凝胶电泳可以精确地确定样品中的目标物含量。
4. 可视化：双向凝胶电泳结果可以直接观察，并且可以使用染色剂或放射性示踪剂对目标蛋白质或核酸进行可视化。
5. 提供局部结构信息：双向凝胶电泳可以提供有关分子的局部结构信息，如转录起始位点、剪接位点等。
6. 适用于高通量分析：双向凝胶电泳可以同时分析多个样品，适用于高通量分析，提高分析效率。
总的来说，双向凝胶电泳具有高分辨率、适用于多种样品、准确度高、可视化、提供局部结构信息和高通量分析等特点，是一种常用的分析技术。
双向电泳的原理
双向电泳的原理双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质和核酸的技术。
它通过两个方向上的电场来实现分离，是一种高效的电泳技术。
双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和两个方向上的电场，下面将详细介绍双向电泳的原理。
首先，双向电泳使用凝胶作为分离介质。
凝胶电泳是一种利用凝胶作为分离介质的电泳技术，通过凝胶孔隙的大小和形状来实现对分子的分离。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等。
在双向电泳中，凝胶可以根据需要调整孔隙大小和形状，以实现对不同大小和电荷的分子的分离。
其次，双向电泳使用两个方向上的电场。
在双向电泳中，样品在水平方向上进行电泳分离，然后在垂直方向上进行电泳分离。
这样可以使得样品在两个方向上都得到有效的分离，提高了分离效率和分辨率。
通过在两个方向上施加不同的电场，可以实现对样品的双向分离。
双向电泳的原理是基于分子的大小和电荷来实现分离。
在水平方向上，分子根据大小被分离，较小的分子移动得更快，较大的分子移动得更慢。
在垂直方向上，分子根据电荷被分离，带正电荷的分子向一个方向移动，带负电荷的分子向另一个方向移动。
通过这种方式，可以实现对复杂混合物中不同分子的高效分离。
双向电泳在生物学和生物化学领域有着广泛的应用。
它可以用于分离和鉴定复杂混合物中的蛋白质和核酸，对于研究细胞信号转导、蛋白质相互作用、基因表达调控等具有重要意义。
双向电泳的原理和技术不断得到改进和完善，使得其在生命科学研究中发挥着越来越重要的作用。
总之，双向电泳是一种基于凝胶电泳和双向电场的分离技术，利用分子的大小和电荷来实现高效的分离。
它在生物学和生物化学领域有着广泛的应用前景，为研究复杂混合物中的蛋白质和核酸提供了重要的技术支持。
随着技术的不断进步，双向电泳将会发挥越来越重要的作用，为生命科学研究带来新的突破和进展。
蛋白质组学研究中的核心技术—双向凝胶电泳
(4)c. 图像分析及数据处理(3)经活检及病理证实，有 12 条为扩张型心肌病特有的蛋白。
(6)RA 和 OA ：类风湿关节炎 (RA) 是一种常见的慢性炎性关节疾病，本病侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理变化为关节滑膜的慢性炎症，细胞侵润，血管翳形成，软骨及骨组织侵蚀，导致关节结构的破坏，功能丧失。
而骨性关节炎 (OA) 其基本病理改变为多种致病因素引起的进行性关节软骨变性，破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一系列的关节症状和体征。
有研究者对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较 RA 与 OA 成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS) 蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异，结果显示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化较 OAFLS 明显增多，其中以相对分子质量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 4227672 ± 8947 ，OAFLS 为 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度扫描值约为 OAFLS 的 6.5倍，两者具有非常显著性差异 (T= 2.820 ， P<0.01) 。
1980 年 Hunter 首先发现酪氨酸激酶 (PTK) ，许多生长因子受体都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因产物也具有 PTK 活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。
1992 年，Williams 等研究发现， RA 滑膜细胞中的 PTK 活性远远高于 OA ，这可能是导致 RA 滑膜细胞转化特性而呈持续活化状态的关键，作者推测RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突变，或多种生长因子受体的持续激活，从而导致转化细胞的外观表现并伴有 PTK 活性的增高。
双向凝胶电泳技术
细胞处理： 对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。 组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，仅需经过 稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。
等电聚焦 等电聚焦是20世纪60年代建立的蛋白质分离技术， 基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同，在 一个稳定的、连续的pH梯度中进行分离和分析。IEF具有 分辨率高（0.01pH单位）、抵消扩散作用、可使浓度较低 的样品达到高度浓缩等优点，不仅可以用来分离两性大分 子，还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立pH梯 度的原理不同，可以分为载体两性电解质pH梯度 （Carrier ampholytes pHgradients）和固体pH梯度 （Immobilized pHgradients）。前者是在电场中通过两 性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质 的一部分，分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式 的不同，IEF可分为管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。 聚焦完成后，胶条既可以在中间电压500-1000V下短时 间保持，便于随时进行第二向的平衡，也可以置于-80℃ 冰箱中进行长期保存。
IPG胶条平衡 在第二向SDS-PAGE分离前，必须要平衡IEF胶。主要 目的是用含有SDS的第二向介质置换含有尿素的第一向介 质，使分离蛋白质与SDS能完全结合，保持蛋白质的巯基 呈还原状态，避免发生重氧化，确保在SDS-PAGE过程中正 常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶内处于其等电点处，净 电荷为零，若未进行平衡过程而直接进入第二向的SDSPAGE分离，蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝胶中 正常迁移。胶条平衡包括两个简单的步骤，每步10-15分 钟，第一步是将IEF胶在375mmol/L Tris-HCl Ph8.8缓冲 液（含2%SDS、1%DTT或6mol/L尿素和30%甘油）中浸泡1015分钟，尿素和甘油是用于缓冲电渗效应，提高蛋白质从 第一向到第二向的转移率。第二步用5%碘乙酰胺替代还原 剂DTT的375mmol/L Tris-HCl pH8.8缓冲液，其他组分及 相应浓度不变。碘乙酰胺用来烷基化巯基变成羟乙酰半胱 氨酸残基，以便巯基不能重组形成二硫键。此外，碘乙酰 胺还可以烷基化IEF胶内的自由DTT，否则自由DTT在第二 向SDS-PAGE胶迁移，会产生点条纹的假象。为减少酰胺基 组的烷基化，最好在pH8-9之间进行还原和烷基化。
第八课双向凝胶电泳
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。 • 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶， 因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓 缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙 烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
2D Gel-Based Proteomics
聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测
• • • • • • • 理想显色剂的7S 安全（safety）： 灵敏（sensitivity）： 简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
• 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证 待研究蛋白的可检测性。
特殊样品的制备
低丰度蛋白的分离：尽管增加上样 量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时 的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰 度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应 而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的 微制备技术进行分离：即将总蛋白组分 成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个 pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品
细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分 级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
样品的溶解
第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
转印至膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
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步骤： SDS-PAGE凝胶的制备 IPG胶条在SDS缓冲液中的平衡 将平衡好的IPG胶条放至 SDS-PAGE凝胶上 质谱相兼容的银染 用SYPRO Ruby 对蛋白质进行 荧光染色 用GelCode磷蛋白染色试剂盒进 行磷蛋白染色
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双向凝胶电泳
制作人：李炳宏
样品的制备 第一向等电聚焦电泳 第二向SDS-PAGE凝胶电泳 蛋白质的显色 印迹法分析双向凝胶的方法
1.中性变性剂 一般是脲素或脲素与脲素 衍生物的混合物
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2.中性或两性去垢剂 非离子型去垢剂（Triton X100,Nonidet P-40） 两性离子去垢剂CHAPS,CHAPSO
透析、凝胶过滤除盐。
2）核酸 影响：导致IEF胶上的酸性区域难以聚 焦，并且对双向凝胶进行 银染时， 核酸会产生高背景；DNA的存在使 样品粘性太高不能有效分离。 去除：超速离心
3).脂类
影响：脂类与蛋白质形成复合物，减少蛋 白质的溶解度，也可以和去垢剂形成复 合物，降低去垢剂的效率。
去除：有机溶剂沉淀。
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SDS(十二烷基磺酸钠) 优点：具有迅速抽提蛋白质的能力，同 时还能使修饰酶失活 缺点：SDS与样品蛋白质结合，干扰蛋 白质的分离
3.还原剂
β-巯基乙醇
巯基还原剂【二硫苏
糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE）】
4.两性电解质溶液或缓冲液
作用:维持蛋白质溶解的最佳pH 条件，以及减少由于电荷之间的相 互作用导致的蛋白质聚集
注意：在第一向分离时缓冲液浓度不 能太高
阳离子缓冲液（如Tris）会向阴极 移动并集中在阴极，导致pH梯度末端分 离效果不佳。 两性电解质溶液（如HEPES）能聚 集在pH梯度中，产生高传导性区域，使 此处蛋白质不能聚焦。
5.干扰物质
1）小离子分子
影响：在第一向分离时增加传导性，会减弱 IEF的整 体效果。 积聚在胶条内的阳极或阴极端，导致高传导性 区域使蛋白质不能在此处聚焦。 去除：沉淀样品中的蛋白或在无盐的样品溶液 中重悬。 沉淀剂有TCA或有机溶剂（如丙 酮，乙醇或氯仿和 甲烷的混合物）。
由凝胶转移到膜上的优点： 蛋白质结合在膜的表面，使得所用的试 剂量非常少 在膜上蛋白质的分离结果不会由于扩散 而被破坏 膜比凝胶坚韧耐用，可以使蛋白质的鉴 定更加精确 膜可以做为实验记录的一部分保存
Thanks
6.防止蛋白质水解－蛋白酶抑制剂 PMSF、AEBSF EDTA 多肽蛋白酶抑制剂(亮抑蛋白酶肽、胃 蛋白酶抑制剂、抑肽酶) 返 回
载体两性电解pH梯度聚丙烯酰胺管状凝胶 固相化pH梯度凝胶（IPG） 优点： 能解决阴极漂移问题 具备更高的负载蛋白质的能力 丙烯酰胺缓冲液是一系列性质很好的分 子，生产上的重复性好，可避免不同批次间产品 的变化