双向凝胶电泳
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SDS(十二烷基磺酸钠) 优点：具有迅速抽提蛋白质的能力，同 时还能使修饰酶失活 缺点：SDS与样品蛋白质结合，干扰蛋 白质的分离
3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ还原剂
β-巯基乙醇
巯基还原剂【二硫苏
糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE）】
4.两性电解质溶液或缓冲液
作用:维持蛋白质溶解的最佳pH 条件，以及减少由于电荷之间的相 互作用导致的蛋白质聚集
透析、凝胶过滤除盐。
2）核酸 影响：导致IEF胶上的酸性区域难以聚 焦，并且对双向凝胶进行 银染时， 核酸会产生高背景；DNA的存在使 样品粘性太高不能有效分离。 去除：超速离心
3).脂类
影响：脂类与蛋白质形成复合物，减少蛋 白质的溶解度，也可以和去垢剂形成复 合物，降低去垢剂的效率。
去除：有机溶剂沉淀。
注意：在第一向分离时缓冲液浓度不 能太高
阳离子缓冲液（如Tris）会向阴极 移动并集中在阴极，导致pH梯度末端分 离效果不佳。 两性电解质溶液（如HEPES）能聚 集在pH梯度中，产生高传导性区域，使 此处蛋白质不能聚焦。
5.干扰物质
1）小离子分子
影响：在第一向分离时增加传导性，会减弱 IEF的整 体效果。 积聚在胶条内的阳极或阴极端，导致高传导性 区域使蛋白质不能在此处聚焦。 去除：沉淀样品中的蛋白或在无盐的样品溶液 中重悬。 沉淀剂有TCA或有机溶剂（如丙 酮，乙醇或氯仿和 甲烷的混合物）。
双向凝胶电泳
制作人：李炳宏
样品的制备 第一向等电聚焦电泳 第二向SDS-PAGE凝胶电泳 蛋白质的显色 印迹法分析双向凝胶的方法
1.中性变性剂 一般是脲素或脲素与脲素 衍生物的混合物
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2.中性或两性去垢剂 非离子型去垢剂（Triton X100,Nonidet P-40） 两性离子去垢剂CHAPS,CHAPSO
6.防止蛋白质水解－蛋白酶抑制剂 PMSF、AEBSF EDTA 多肽蛋白酶抑制剂(亮抑蛋白酶肽、胃 蛋白酶抑制剂、抑肽酶) 返 回
载体两性电解pH梯度聚丙烯酰胺管状凝胶 固相化pH梯度凝胶（IPG） 优点： 能解决阴极漂移问题 具备更高的负载蛋白质的能力 丙烯酰胺缓冲液是一系列性质很好的分 子，生产上的重复性好，可避免不同批次间产品 的变化
返 回
步骤： SDS-PAGE凝胶的制备 IPG胶条在SDS缓冲液中的平衡 将平衡好的IPG胶条放至 SDS-PAGE凝胶上 第二向凝胶电泳
返 回
胶体考马斯亮蓝染色 银氨染色 与质谱相兼容的银染 用SYPRO Ruby 对蛋白质进行 荧光染色 用GelCode磷蛋白染色试剂盒进 行磷蛋白染色
返 回
由凝胶转移到膜上的优点： 蛋白质结合在膜的表面，使得所用的试 剂量非常少 在膜上蛋白质的分离结果不会由于扩散 而被破坏 膜比凝胶坚韧耐用，可以使蛋白质的鉴 定更加精确 膜可以做为实验记录的一部分保存
Thanks
SDS(十二烷基磺酸钠) 优点：具有迅速抽提蛋白质的能力，同 时还能使修饰酶失活 缺点：SDS与样品蛋白质结合，干扰蛋 白质的分离
3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ还原剂
β-巯基乙醇
巯基还原剂【二硫苏
糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE）】
4.两性电解质溶液或缓冲液
作用:维持蛋白质溶解的最佳pH 条件，以及减少由于电荷之间的相 互作用导致的蛋白质聚集
透析、凝胶过滤除盐。
2）核酸 影响：导致IEF胶上的酸性区域难以聚 焦，并且对双向凝胶进行 银染时， 核酸会产生高背景；DNA的存在使 样品粘性太高不能有效分离。 去除：超速离心
3).脂类
影响：脂类与蛋白质形成复合物，减少蛋 白质的溶解度，也可以和去垢剂形成复 合物，降低去垢剂的效率。
去除：有机溶剂沉淀。
注意：在第一向分离时缓冲液浓度不 能太高
阳离子缓冲液（如Tris）会向阴极 移动并集中在阴极，导致pH梯度末端分 离效果不佳。 两性电解质溶液（如HEPES）能聚 集在pH梯度中，产生高传导性区域，使 此处蛋白质不能聚焦。
5.干扰物质
1）小离子分子
影响：在第一向分离时增加传导性，会减弱 IEF的整 体效果。 积聚在胶条内的阳极或阴极端，导致高传导性 区域使蛋白质不能在此处聚焦。 去除：沉淀样品中的蛋白或在无盐的样品溶液 中重悬。 沉淀剂有TCA或有机溶剂（如丙 酮，乙醇或氯仿和 甲烷的混合物）。
双向凝胶电泳
制作人：李炳宏
样品的制备 第一向等电聚焦电泳 第二向SDS-PAGE凝胶电泳 蛋白质的显色 印迹法分析双向凝胶的方法
1.中性变性剂 一般是脲素或脲素与脲素 衍生物的混合物
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2.中性或两性去垢剂 非离子型去垢剂（Triton X100,Nonidet P-40） 两性离子去垢剂CHAPS,CHAPSO
6.防止蛋白质水解－蛋白酶抑制剂 PMSF、AEBSF EDTA 多肽蛋白酶抑制剂(亮抑蛋白酶肽、胃 蛋白酶抑制剂、抑肽酶) 返 回
载体两性电解pH梯度聚丙烯酰胺管状凝胶 固相化pH梯度凝胶（IPG） 优点： 能解决阴极漂移问题 具备更高的负载蛋白质的能力 丙烯酰胺缓冲液是一系列性质很好的分 子，生产上的重复性好，可避免不同批次间产品 的变化
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步骤： SDS-PAGE凝胶的制备 IPG胶条在SDS缓冲液中的平衡 将平衡好的IPG胶条放至 SDS-PAGE凝胶上 第二向凝胶电泳
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胶体考马斯亮蓝染色 银氨染色 与质谱相兼容的银染 用SYPRO Ruby 对蛋白质进行 荧光染色 用GelCode磷蛋白染色试剂盒进 行磷蛋白染色
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由凝胶转移到膜上的优点： 蛋白质结合在膜的表面，使得所用的试 剂量非常少 在膜上蛋白质的分离结果不会由于扩散 而被破坏 膜比凝胶坚韧耐用，可以使蛋白质的鉴 定更加精确 膜可以做为实验记录的一部分保存
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