SOP-甘油菌制备标准操作规程

1．目的：建立制备甘油菌的标准操作规程。

2．范围：本规程适用于以甘油菌的方式保存工程菌或建立工作种子库。

3．职责：种子库建立相关操作人员对本规程负责。

4．程序：

4．1 准备工作

4.1.1 试剂：

80％甘油：参考SOP3001

4ml、25ml LB液体培养基：参考SOP3002

30mg/ml卡那霉素母液：参考SOP3001

4.1.2 仪器：

超净工作台、恒温摇床、低温冰箱。

4.2 实验操作

4.2.1 绘制生长曲线

4.2.1.1 挑取单克隆菌落于无菌条件下接种4ml LB液体培养，加入4ul卡那霉

素母液，使其终浓度达到30ug/ml，37℃，200rpm振摇3h。

4.2.1.2 保存于4℃冰箱。

4.2.1.3 第二天从冰箱中取出振摇的菌种，37℃，200rpm继续振荡培养30min。

4.2.1.4 记录0D600的吸光值。

4.2.1.5 以1％的接种量接种一瓶新鲜的25mlLB液体培养基，37℃，200rpm振

荡培养，记录此时（0小时）的OD600吸光值为4.2.1.4数值的1％。

4.2.1.6 每培养1个小时测OD600一次，并记录数据。

4.2.1.7 时间（h）为横坐标，OD600吸光值为纵坐标做散点图绘制细菌生长曲

线，待细菌生长达到平台期时停止检测OD600吸光值。

4.2.1.8 根据图找出细菌刚刚进入指数生长期的时间点，计为Tp（time point）。

4.2.2 保存菌种

4.2.2.1 按照4.2.1.1-4.2.1.3操作。

4.2.2.2 以1％的接种量转接一瓶25ml LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养

至Tp。

4.2.2.3 每支冻存管分装812 ul培养的菌液，加入188ul 80％的甘油，使甘油

的终浓度为15％。

4.2.2.4 -20℃或-70℃保存。

4.3 注意事项：

4.3.1 4.2.2保存菌种严格按照无菌操作，分装菌种前要对超净工作台再次灭菌

15-30 min。

4.4参考依据：

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