HPLC 仪器操作与维护

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手动进样器原理
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手动进样器的使用
7725i手动进样器的进样方式: —固定体积进样:进样量取决于Loop的体积 —可变体积进样:进样量由微量注射器量取 注意: —固定体积进样需要用超过Loop体积5-10倍的样品量 进样,以保证进样浓度不被稀释 —可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器扳 至Inject位置,以避免样品在Loop中的扩散 进样器的清洗: —每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉 污染,影响实验结果
Standard
Total Recovery
Max Recovery
QSert
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自动进样器的清洗
717和2695进样器的清洗: —进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗 —进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗 —若注射器内出现气泡，用面板操作的Purge Injector功能清除之 2795进样器的清洗 —进样针是离线的,底部开口 —Wash Solvent 应用高比例的有机相水溶液 —Purge Solvent 应用低比例的有机相水溶液
注射器箱门 柱温箱
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2695 排气操作示意图
面板操作 :
— 打开状态(Statas)画面 — 按右下角Direct Function功能键 — 选 Dry Pime或 Wet Prime命令 — 选OK 即可进行泵的排气
注:
— 当流路中充满空气时, 按图示做Dry Prime — 若只是更新流动相时, 只须作Wet Prime
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流动相的脱气
流动相脱气的目的 —使色谱泵的输液准确 —输液量均匀准确，并且脉动减小 —保留时间及色谱峰面积的重现性提高 —提高检测的性能 —防止气泡引起的尖峰 —基线稳定，信噪比增加 —溶剂的紫外吸收本底降低 —保护色谱柱 —减少死体积 —防止填料的氧化
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色谱泵及系统的清洗
清洗液用30%磷酸水溶液 30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀 清洗步骤如下: —取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器 —用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) —用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟 — (四元泵的A,B,C,D四路各为25%) —换成清水洗至出口水pH显中性 —用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
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实验样品的制备
标样和样品 —标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的 参考标准物,一般是纯度较高的纯物质 —样品:待测物,一般是成分复杂的混合物 液相色谱对样品(包括标样)制备的要求: —必须能溶于流动相 —如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解 度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和 色谱柱 —样品溶液要过滤除去微粒及杂质 —了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用
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色谱泵的运行
排气后的色谱泵即可用于实验运行 —注意∶ —排气后，先设流速为 0 —恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 —如需要，恢复排气时断开的控制线 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排 气操作)
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流动相脱气的方法
加热
— 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的 变化
抽真空
— 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果
超声波振荡
— 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)
通惰性气体（一般用氦气）
— 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度
泵B
柱塞杆清洗孔
参比阀 -到进样器 -到废液 排液阀 (A)
泵A
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Waters 600 泵的前面板
泵控制器 电源开关
柱塞杆 清洗孔
排液阀
泵体 泵灌注阀
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Waters 2695 分离单元
溶剂瓶盘 检测器接液盘 前面板显示 屏和键盘 软盘驱动器 样品室门 溶剂输送单 元进入门 溶剂配比单元 进入门
在线脱气机 （in-line degasser)
— 可保持连续脱气，多用于低压梯度
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流动相的保存
有机溶剂流动相: —室温下密封,避光保存 缓冲盐流动相: —当日现配现用 —低温下密封保存,一般不超过3天 —防止微生物生长 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相: —低温密封保存 —防止有机相的挥发 选用适宜的容器
液相色谱仪器操作及维护
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启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 —打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自 检后，打开计算机，启动色谱管理软件 准备流动相 —过滤,脱气 色谱泵排气 —用新配制的流动相灌注泵
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液相色谱仪器对流动相的要求 —与检测器匹配 —脱气 —避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） —溶剂的粘度 —防止细菌的生长
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液相色谱对流动相的要求
色谱柱对流动相的要求 —过滤除去微粒 —纯度的要求 —超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 —有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)， 并与填料相匹配 —缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内 —缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) —流动相对样品的溶解度 —调整有机溶剂和水的比例 —最好用流动相溶样
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自动进样器的使用
自动进样器(717Plus和2695样品管理系统): —样品瓶位置和进样量由软件设定 注意: —样品瓶中应有超过1／3瓶高度的样品量 —样品瓶中的样品也不要装得太满,应留有一定的空气 —使用内衬管(Insert)时应设定针高度为2mm(2695) 或75%高度(717Plus) —使用仪器生产商推荐的样品瓶
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色谱泵及系统的钝化
钝化液用6M硝酸水溶液 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 钝化步骤如下: —在清洗步骤完成后进行钝化处理 —确认清洗用的磷酸已基本洗净 —用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) —用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟 —换成清水洗至出口水pH显中性 —用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用
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色谱泵的维护保养
流动相要过滤 常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞 杆清洗孔 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要 用一种中间溶剂过渡 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满 泵头及管路,并保存在纯甲醇中
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自动进样器的使用
了解进样针的设计特点 —侧面开口与底部开口
侧孔吸样 底部吸样
717和2690/2695
2790/2795
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选用合适的进样瓶及密封垫
Bottom Draw
Side Draw
Bottom Draw
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保存于棕色玻璃瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期 1天 新鲜配制
0
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色谱泵的排气操作
色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按 以下步骤排气：
— 将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中 — 打开泵及在线脱气机电源开关 — 将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路 — 设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出 — 必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相 — 对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作 — 停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用
注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十 Psi以内),否则,需重做排气操作
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Waters 515 泵的前面板
电源开关
柱塞杆清洗孔
排液阀
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Waters 1525 泵
排液阀(B) 柱塞杆清洗孔
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保存于聚乙烯瓶中的超纯水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
2 星期 1 星期 1天 1 小时 新鲜配制 0 5 10 分
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自动进样器的洗针液
洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：
流动相 缓冲溶液，反相 纯缓冲溶液 非水溶液，反相 正相 GPC 离子交换 洗针溶剂 50% 水 ∶ 50% 甲醇 100% 水 100% 甲醇 流动相 流动相 对离子试剂的水溶液
注意∶ —洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部， 应放于与仪器同一水平面的实验台上
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启动液相色谱仪器的流程
用准备好的流动相平衡色谱系统 —可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件 控制下操作) —系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作 准备样品 —用流动相溶样或重组样品 编制仪器方法,开始实验
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液相色谱对流动相的要求
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检测器的启动操作
连通流路： —色谱柱出口接检测器入口
—注意接头不要留有空隙 —连接管路要用细管(≤0.009″)
—检测器出口用适当的管路(内径,长度)通向废液瓶 连通数据线路: —IEEE 电缆(对大多数检测器)与软件busLAC/E卡连接 —手动进样器的启动信号线与检测器背板上的Inject Start 接口连接 开启电源开关后,需待检测器通过自检后,才能被软件控制(约 需5-10分钟) 通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作
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进样器的使用
进样器的种类: —手动进样器－7725i —自动进样器－717Plus，2695样品管理系统 进样器与系统的连接： —进样器的入口与色谱泵的出口相连 —进样器的出口与色谱柱的入口相连 —要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙 进样器的连接管路： —出口管路一定要用细管(内径≤0.009″),长度要短, 尽量减少谱带扩展
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液相色谱系统的清洗与钝化
色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若 被污染,应作清洗和钝化处理 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为 钝化剂，先清洗再钝化 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧 化膜
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去除微粒的方法
过滤 —过滤膜/过滤装置 —有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) —膜片可更换 —一次性使用的膜“Cartridge” —使用方便简单，交叉污染小 —有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 —大于：10,000rpm