实验五--核酸琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的核酸分子量分析方法。
在琼脂糖
凝胶电泳中，核酸样品首先被混合到琼脂糖凝胶中，然后通过电场
进行分离。
琼脂糖凝胶的孔隙大小会影响核酸分子的迁移速度，从
而实现分子量的分离。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸分子量的过程中，我们需要考虑一些
因素。
首先是琼脂糖的浓度，不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离不同
范围大小的核酸分子。
其次是电场的强度和时间，这些参数会影响
核酸分子的迁移速度和分离效果。
另外，还需要考虑使用何种缓冲
液来维持电泳过程的稳定性。
在实际操作中，我们通常会使用DNA或RNA分子量标准品作为
参照物，通过与标准品的比较来确定待测核酸分子的分子量。
此外，琼脂糖凝胶电泳也可以结合染色剂如乙溴化蒽酮（Ethidium Bromide）来观察核酸分子的迁移情况，从而进一步分析核酸的分子量。
总的来说，琼脂糖凝胶电泳是一种简单而有效的核酸分子量分
析方法，通过合理设置实验条件和对照标准品，可以准确地分离和
测定核酸分子的分子量。
这种方法在生物学和分子生物学领域被广泛应用，为研究人员提供了重要的实验数据。
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。
普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。
低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。
注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。
电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。
注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。
琼脂糖凝胶电泳实验
琼脂糖凝胶电泳实验⼀、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA ⽚段的常⽤技术。
把DNA样品加⼊到⼀块包含电解质的多孔⽀持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。
由于DNA分⼦的双螺旋⾻架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
在⼀定的电场强度下，DNA分⼦的迁移速度取决于分⼦筛效应。
具有不同的相对分⼦质量的DNA⽚段泳动速度不⼀样，因⽽可依据DNA分⼦的⼤⼩来使其分离。
凝胶电泳不仅可分离不同分⼦质量的DNA，也可以分离相对分⼦质量相同，⽽构型不同的DNA分⼦。
在电泳过程中可以通过⽰踪染料或相对分⼦质量标准参照物和样品⼀起进⾏电泳⽽得到检测。
相对分⼦质量标准参照物相对可以提供⼀个⽤于确定DNA⽚段⼤⼩的标准。
在凝胶中加⼊少量溴化⼄锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分⼦可插⼊DNA的碱基之间，形成⼀种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红⾊荧光，因此也可对分离的DNA进⾏检测。
⼀般琼脂糖凝胶电泳适⽤于⼤⼩在0.2kb～50kb范围内的DNA⽚段。
三种不同构型分⼦进⾏电泳时的迁移速度⼤⼩顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的⽤来进⾏⼤⽚段核酸的电泳，⾼浓度的⽤来进⾏⼩⽚段分析。
低浓度胶易碎，⼩⼼操作和使⽤质量好的琼脂糖是解决办法。
注意⾼浓度的胶可能使分⼦⼤⼩相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液常⽤的缓冲液有TAE和TBE，⽽TBE⽐TAE有着更好的缓冲能⼒。
电泳时使⽤新制的缓冲液可以明显提⾼电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使⽤后，离⼦强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产⽣条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳⼀定要使⽤DNA Marker或已知⼤⼩的正对照DNA来估计DNA⽚段⼤⼩。
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告
琼脂糖凝胶电泳检测实验报告一、实验目的本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，对DNA分子进行分离和检测，掌握琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解其在生物学领域中的应用。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离DNA分子的方法。
其原理是利用电场作用力将DNA分子从样品中移动到凝胶中，并根据DNA分子大小不同，在凝胶中形成不同迁移距离的带状图案。
根据带状图案可以得到DNA片段大小及其相对含量。
三、实验步骤1.制备琼脂糖凝胶：将1g琼脂糖加入100ml TAE缓冲液中，加热搅拌至溶解，冷却至60℃左右时倒入模具中，待冷却成固体后取出。
2.制备DNA样品：将待检测DNA样品加入适量TAE缓冲液中，使其浓度为50ng/ul。
3.装载样品：取出制备好的琼脂糖凝胶，将其置于电泳槽中，加入适量TAE缓冲液，然后将DNA样品注入琼脂糖凝胶孔中。
4.进行电泳：将电泳槽盖好，接通电源，设定电压和时间，进行电泳。
5.染色和成像：取出琼脂糖凝胶，进行染色处理，然后用成像仪拍摄带状图案。
四、实验结果通过琼脂糖凝胶电泳检测方法，成功分离出待检测DNA样品中的DNA分子，并形成了带状图案。
根据带状图案可以看出不同大小的DNA片段在凝胶中形成了不同迁移距离的带状图案。
五、实验分析1.影响DNA迁移距离的因素：DNA片段大小、琼脂糖浓度、电场强度等因素都会影响DNA分子在凝胶中的迁移距离。
一般来说，较小的DNA片段在相同条件下迁移距离较大。
2.应用领域：琼脂糖凝胶电泳技术广泛应用于生物学领域中对DNA分子的检测和分析。
例如，可以用于分析DNA序列、检测基因突变等。
六、实验总结通过本次实验，我们掌握了琼脂糖凝胶电泳技术的操作步骤和原理，并了解了其在生物学领域中的应用。
同时，我们也发现琼脂糖凝胶电泳技术具有操作简单、成本低廉、结果可靠等优点，是一种常用的DNA分子检测方法。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
质粒的提取及凝胶糖凝胶电泳鉴定
实 验 步 骤
50 mM 葡萄糖 25 mM Tris-HCl 10 mM EDTA-Na2
200 mM NaOH 1% （W/V） SDS
2
5 min
3 M NaAC
省去Leabharlann 30 min 以上四、DNA的琼脂糖凝胶电泳原理
不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电 泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带。
8.12000rpm，4℃，离心10min，弃上清，将管口倒置于纸巾上使所有液体尽 可能流出。
9.加入1ml70%乙醇洗沉淀一次。12000rpm，4℃，离心10min。 10.弃上清，将管口倒置于纸巾上使液体流尽，放置干燥或真空干燥，即得质粒 DNA制品。 11.将沉淀溶于20ulTE缓冲液，（临用前加入1u 或20ug/ml RNaseA）待用。
细菌质粒是基因工程中常用的基因载体，也是 分子生物学中研究基因结构、功能及其复制、表达 的好材料。
二、实验原理
碱变性抽提法法是常用的方法之一. 此法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异而达
到分离的目的。
在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺 旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺 旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用 pH4.8 的 Kac 高 盐 缓 冲 液 调 节 pH 至 中 性 时 ， 变 性 的 质 粒 DNA又恢复到原来的构型，以可溶性状态存在于液相中， 而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳 定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
2.凝胶板的制作： 用1cm宽的胶带纸沿平板电泳槽模板两 端边缘围成高4mm的墙，在其一端放置样品梳。将准备好的 模板置于水平台上，迅速将上面 胶液倒在模板的中央，让胶液自 由流向四周。待胶液充分冷却凝 固，将胶纸围墙慢慢取下，制备 好的凝胶板放入电泳槽中，加电 泳缓冲液直至没过胶面约1mm深， 取出样品梳。
琼脂糖凝胶电泳整个详细操作流程
琼脂糖凝胶电泳整个详细操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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生化实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳
加样缓冲液
0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp) 0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖
EB（溴化乙锭）染色液（有毒）
0.5ug /ml，用水配制
溴化乙锭(ethidium bromide，EB)
每一种限制性内切酶都有特定的反应条件 pH范围：7.5~8.0
缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷） NaCl、MgCl2、 巯基乙醇
温度：37℃
琼脂糖凝胶电泳
是一种简便、快速的分离纯化 和鉴定核酸的方法。
琼脂糖是一种线性多糖聚合 物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷 却凝固,会形成良好的电泳介质。
是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸 的碱基对之间，在紫外线激发下，发出 桔红色荧光。
电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB 溶液中染色10min。在紫外光照射下可见 核酸电泳带，DNA量一般>5ng。
操作步骤
酶切反应
反应体系
λ－DNA 10 x Buffer Hind III H2O
电泳
在电场的作用下，在某种支持介 质上，将一个混合物分离成若干条 区
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0
线型DNA分离范围(Kb)
5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2
试剂
TBE电泳缓冲液
Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye
实验五 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
2、胶板的制备
①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内 槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液（约40ml），缓缓倒入 有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面
（注意不要形成气泡）。
④待胶完全凝固后，双手轻用力取出梳子（注意勿使样 品槽破裂），即可见到长方形孔格，取下橡皮膏，放在 电泳槽内。
⑤加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，使胶板淹没。
3、点样
①取8μl DNA样品液与2μl 溴酚蓝染液(体积比:4/1) 混合 。
②用微量移液器分别加入 到凝胶板的点样孔内。每 个点样孔加10μl左右。
注意：加样时，移液 器枪头穿过缓冲液小心插 入点样孔，但不要损坏点 样孔，然后缓慢地将样品 推进孔内让其集中沉于孔 底部。
三、材料与试剂
➢ 1、材料：
①提取的叶片总DNA
➢ 2、试剂
① 50×TAE（50倍体积的TAE贮存液）
配100ml 50×TAE：
Tris
24.2g
冰醋酸
5.71ml
0.5mol/L EDTA 10ml（pH8.0）
用前稀释成1×TAE 。
② 凝胶加样缓冲液（6×）：
溴酚蓝 0.25%
蔗糖 40%
4、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如 溴酚蓝），用以指示样品移动的距离。
七、作业
为什么要在制琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭？
相对分子质量不同的DNA分子，移动速度也不同， 所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。
3、0.6~1.4%琼脂 糖凝胶适用于
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的 范围
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、实验目得:琼脂糖凝胶电泳就是常用得检测核酸得方法,具有操作方便、经济快速等优点。
DNA琼脂糖凝胶电泳得使用技术仅代表具备操作琼脂糖电泳得能力。
二、实验原理:琼脂糖凝胶电泳就是常用得用于分离、鉴定DNＡ、ＲＮA分子混合物得方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时得电荷效应与分子筛效应,达到分离混合物得目得。
DＮＡ分子在高于其等电点得溶液中带负电,在电场中向阳极移动。
在一定得电场强度下,DNA分子得迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身得大小与构型就是主要得影响因素。
DＮA分子得迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型得ＤＮＡ分子得迁移速度不同。
如环形ＤNA 分子样品,其中有三种构型得分子:共价闭合环状得超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDＮA)、与线形DＮA分子(IDNA)。
这三种不同构型分子进行电泳时得迁移速度大小顺序为:cccDNA〉ＩDN Ａ>ocＤNA、影响核酸分子泳动率得因素主要还就是:1、DＮＡ分子大小;2、琼脂糖浓度;３、DＮＡ构想;4、所用得电压;５、琼脂糖种类;6、电泳缓冲液。
核酸电泳中常用得染色剂就是溴化乙锭(ethidｉum bromiｄe EB)。
溴化乙锭就是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链得配对碱基之间、在紫外线照射ＢＥ-DNA复合物时,出现不同得效应、2５4ｎm得紫外线照射时,灵敏度最高,但对ＤNA损伤严重;360ｎm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对ＤNＡ损伤小,所以适合对ＤＮA样品得观察与回收等操作。
3００nm紫外线照射得灵敏度较高,且对ＤNA损伤不就是很大,所以也比较适用。
三、材料、试剂及器具1、材料:不同大小得基因组片段2、试剂:Hｉnd III diｇｅｓｔDNA Marker(分子量标准)(TaKaRa);D2000(TianGeｎ);琼脂糖;加样缓冲液(6x):溴酚蓝;电泳缓冲液(1×TAE);溴化乙锭(EB);3、仪器及器具:(1)移液器、吸头、锥形瓶(2)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。
PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的1. 掌握PCR扩增技术的基本原理2. 掌握PCR的常规操作3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用4. 了解PCR技术的应用5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素二、实验原理1. PCR基本原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
2. PCR反应体系3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。
核酸电泳原理
核酸电泳原理
核酸电泳是一种分离和分析DNA或RNA的方法，其原理基于核酸在电场下的运动速率受其分子长度和电荷量的影响。
首先，核酸样品会被加入到含有琼脂糖的琼脂糖凝胶中。
琼脂糖凝胶是一种聚合物基质，具有孔隙结构。
这些孔隙可以使核酸分子根据其大小和电荷移动通过。
然后，在电泳槽两端建立一个电场，通常是通过在槽中放置两个电极并连接电源。
核酸样品会在电场作用下沿着凝胶孔隙向电极移动。
较小的核酸片段移动得更快，而较大的核酸片段移动得更慢。
在电泳过程中，核酸样品会在凝胶中形成一条或多条带状物。
这些带状物的位置和宽度反映了核酸样品中不同片段的大小和相对丰度。
为了可视化这些带状物，可以在核酸中加入荧光染料或通过其他方法进行标记。
然后，在电泳结束后，可以使用影像分析仪或紫外光照射来观察和记录核酸带状物的位置和强度。
总的来说，核酸电泳是通过利用核酸分子在电场下的运动速率差异来分离和分析核酸样品中的不同片段。
它是一种常用的核酸研究技术，可以用于检测DNA或RNA的长度、纯度、相对丰度以及其他相关信息。
琼脂糖凝胶电泳
分辨率与凝胶浓度的关系？ 3、DNA荧光染料的发光原理？
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分 子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分 子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子 量的对数值成反比关系。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分 子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度 大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
（一）制胶
1、称取1.5g琼脂糖加入盛有100 ml 0.5TAE电泳缓冲液的250 ml三角瓶中， 摇匀，在微波炉上加热至琼脂糖完全溶 解。冷却到约60℃后，加入10 l的EB， 并摇匀。
2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模 具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的 梳子，在室温下冷却凝固。
五、实验用具
移液器 吸管头若干 加样板 量筒100 ml1 三角瓶500 ml1
六、试剂
琼脂糖 50TAE电泳缓冲液 6 载样缓冲液 （loading buffer） 溴化乙锭(EB) DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III
七、实验步骤
（一）制胶（1% agarose gel） （二）点样 （三）电泳 （四）观察
实验三、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，用于分 离、鉴定和纯化DNA片段。凝胶中DNA的位置可以用 低浓度的荧光插入染料染色直接观察。
琼脂糖凝胶电泳实验报告
琼脂糖凝胶电泳实验报告一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分离和分析DNA、RNA 等核酸分子。
本次实验的目的是：1、掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
2、学会制备琼脂糖凝胶，并能够正确上样和进行电泳。
3、能够通过电泳结果判断核酸样品的质量、大小和浓度。
二、实验原理琼脂糖是一种从海藻中提取的多糖，加热溶解后冷却可形成凝胶。
琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构，能够起到分子筛的作用。
核酸分子在电场中会向正极移动，由于其分子大小、形状和电荷密度的不同，在琼脂糖凝胶中的迁移速度也不同。
小分子的核酸迁移速度快，大分子的核酸迁移速度慢，从而实现分离。
DNA 和 RNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度主要取决于以下因素：1、分子大小：分子越大，迁移速度越慢。
2、分子构象：超螺旋 DNA 比线性 DNA 迁移速度快，而线性DNA 又比开环 DNA 迁移速度快。
3、琼脂糖浓度：琼脂糖浓度越高，凝胶孔径越小，对分子的阻碍作用越大，迁移速度越慢。
4、电场强度：电场强度越大，迁移速度越快，但过高的电场强度可能导致发热和条带扭曲。
在电泳过程中，通常使用溴化乙锭（EB）或其他核酸染料对核酸分子进行染色，以便在紫外灯下观察和拍照。
三、实验材料和仪器1、材料DNA 样品：已知大小的 DNA 标准品、待测 DNA 样品。
琼脂糖：电泳级琼脂糖。
电泳缓冲液：常用的有 TAE（Tris乙酸EDTA）和 TBE（Tris硼酸EDTA）缓冲液。
核酸染料：溴化乙锭（EB）或其他安全的核酸染料。
上样缓冲液：通常含有甘油、溴酚蓝等成分，用于增加样品密度和指示电泳进程。
2、仪器电泳仪：提供稳定的电场。
水平电泳槽：用于容纳琼脂糖凝胶和进行电泳。
微波炉：用于加热溶解琼脂糖。
紫外透射仪：用于观察和拍照电泳结果。
移液器：用于准确量取和移取液体。
四、实验步骤1、制备琼脂糖凝胶称取适量的琼脂糖粉末，加入一定量的电泳缓冲液，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解，溶液澄清透明。
实验琼脂糖凝胶电泳的原理与方法 PPT
六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
按电泳法分:
按超速离心法分:
乳糜微粒(CM)
乳糜微粒CM ( < 0、96 )
-脂蛋白 (-位) 极低密度脂蛋白VLDL(0、961、006)
前-脂蛋白(2-位) 低密度脂蛋白LDL (1、0191、063) -脂蛋白 (1-位) 高密度脂蛋白HDL(1、0631、21)
进行印迹转移电泳时,要注意缓冲液得离子强度要低,pH要远 离pI,使蛋白质带有较多电荷,一般用稳定性较好得Tris-缓冲体 系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高电压或 电流可以提高转移速度,但亦会增加热效应,故电压或电流不可过 高。
五、交变脉冲电场凝胶电泳
一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb得DNA。 这就是因为在琼脂糖凝胶中,DNA分子得有效直径超 过凝胶孔径时,在电场作用下,迫使DNA变形挤过筛孔, 而沿着泳动方向伸直,因而分子大小对迁移率影响不 大。如此时改变电场方向,则DNA分子必须改变其构 象,沿新得泳动方向伸直,而转向时间与DNA分子大小 关系极为密切。
D-半乳糖
3,6-脱水-L-半乳糖
琼脂糖链依分子内与分子间氢键及其它力得作 用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝 胶。
冷却
松散,随机地,盘绕地琼脂糖链
双螺旋结构区域与线性链相链接
淬火
溶胶状态
初级胶
最终得凝胶结构
琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,其优点如下: (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事
按支持物得装置形式不同,区带电泳可为: ➢平板式电泳,支持物水平放置,就是最常用得 电泳方式; ➢垂直板式电泳,聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直 板式电泳; ➢垂直柱式电泳,聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即 属于此类; ➢连续液动电泳,首先应用于纸电泳,将滤纸垂 直竖立,两边各放一电极,溶液自顶端向下流, 与电泳方向垂直。
琼脂糖凝胶电泳实训报告
一、实验目的通过本次实训，掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作步骤，学习利用琼脂糖凝胶电泳技术分离、鉴定DNA片段，并了解实验结果的分析方法。
二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，利用琼脂糖凝胶作为电泳介质，根据DNA分子大小和所带电荷的不同，在电场作用下实现DNA分子的分离。
琼脂糖凝胶是一种多聚糖，具有良好的胶凝性和稳定性，其形成的凝胶具有网状结构，孔径大小可调节，能够对DNA分子进行筛选和分离。
在琼脂糖凝胶电泳过程中，DNA分子在电场作用下向正极移动，其迁移速率受到以下因素的影响：1. DNA分子的大小：分子越大，迁移速率越慢。
2. DNA分子的电荷：在高于其等电点的pH溶液中，DNA分子带负电荷，向正极移动。
3. 电场强度：电场强度越大，DNA分子的迁移速率越快。
4. 琼脂糖凝胶的孔径：孔径越大，分子迁移速率越快。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：DNA样品、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准品、TAE缓冲液、DNA染色剂等。
2. 实验仪器：电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、微量移液器、凝胶成像系统等。
四、实验步骤1. 准备琼脂糖凝胶：按照实验要求配制TAE缓冲液，加入琼脂糖，加热溶解后，冷却至60℃左右，加入DNA样品，混匀后倒入电泳槽，待凝胶凝固。
2. 准备DNA分子量标准品：将DNA分子量标准品稀释至适当浓度，备用。
3. 加样：将DNA样品和DNA分子量标准品分别加入琼脂糖凝胶的样品孔中，注意避免样品溢出。
4. 电泳：接通电源，调整电压至适当值，进行电泳。
5. 染色：电泳结束后，取出凝胶，加入DNA染色剂，染色5-10分钟。
6. 观察结果：使用紫外透射仪观察凝胶，记录DNA片段的迁移距离，并与DNA分子量标准品进行比较，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 观察到DNA分子量标准品在琼脂糖凝胶中形成了清晰的区带，且区带之间的距离与DNA分子量大小呈正相关。
2. 实验样品在琼脂糖凝胶中也形成了清晰的区带，且区带大小与DNA分子量标准品相符。
核酸凝胶电泳步骤
核酸凝胶电泳步骤核酸凝胶电泳是一种常用的分离和检测核酸分子的方法，它基于核酸分子在电场作用下的迁移速度差异而进行分离。
本文将以核酸凝胶电泳的步骤为标题，介绍其详细内容。
一、制备凝胶核酸凝胶电泳中常用的凝胶材料有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
首先，将所需的凝胶材料加入缓冲液中，根据需要加热溶解。
然后，将溶液倒入凝胶模具中，插入梳子以形成样品槽。
等凝胶凝固后，取出梳子并将凝胶放入电泳槽中。
二、制备样品将待检测的核酸样品进行处理，通常需要提取和纯化核酸。
然后，将样品加入到一定量的加载缓冲液中，混匀后可以进行加载。
三、加载样品将样品溶液缓慢地加入到凝胶的样品槽中，注意不要产生气泡。
可以使用专门的样品加载器进行操作，以确保样品加载均匀。
四、电泳将凝胶浸入电泳缓冲液中，然后接通电源，设置合适的电压和电流。
在电泳过程中，核酸分子会受到电场力的作用而向电极方向迁移。
较短的核酸分子迁移速度较快，较长的核酸分子迁移速度较慢。
五、染色电泳结束后，需要对凝胶进行染色以可视化核酸带。
常用的染色剂有溴化乙锭和SYBR Green等。
将染色剂加入到染色缓冲液中，将凝胶浸泡在染色溶液中一定的时间，然后用脱色剂洗净凝胶。
六、结果分析观察染色后的凝胶，核酸带会在凝胶上呈现出不同的迁移距离。
根据核酸带的迁移距离和已知标准品的迁移距离进行比较，可以确定待测样品中的核酸分子大小或浓度。
核酸凝胶电泳是一种常用的核酸分离和检测方法，可以用于DNA 和RNA分子的分析。
通过制备凝胶、制备样品、加载样品、电泳、染色和结果分析等步骤，可以获得核酸分子的迁移距离信息，从而对核酸样品进行分析。
这种方法简单易行，广泛应用于生物学和分子生物学领域的实验研究中。
核酸凝胶电泳是一种重要的实验技术，通过凝胶制备、样品处理、电泳分离、染色和结果分析等步骤，可以对核酸分子进行分离和检测。
这种方法在分子生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，为我们深入了解核酸分子的结构和功能提供了重要的手段。
琼脂糖凝胶电泳检测
凝胶成像分析系统
Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker （Ferments）
一个已知分子质量的 DNA样品做最对照， 用来确定待测样品的 相对分子质量。
• 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成 像系统)等。
• 琼脂糖、 1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、 6X载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和DNA 分子量标准（ Lambda DNA / EcoRI + HindIII Marker ）等。
凝胶电泳系统
美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell
（2 ）加样： 5μl质粒DNA+1μl loading buffer ，混匀
15μlPCR产物+3μl loading buffer，混匀 10μl酶切产物+2μl loading buffer，混匀
6μlDNAMark （每板胶加一孔）
（3 ）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 （4 ）染色：EB染色约15min
• EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废 液要经过处理才能丢弃。
• SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品 中，价格较昂贵。
【五】实验步骤
1. 制备琼脂糖凝胶（1%） 2. 制备凝胶板 3. 加样 4. 电泳 5. 染色 6. 结果观察
（1）制备凝胶和胶板：
45ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(46mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。 胶板设计（44人）： • 每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板 • 每8孔胶板（2人X3样品+ 1marker ），2胶板
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实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学
习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的
一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和
构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫
外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
［琼脂糖凝胶浓度与线n：DN A分离范围参数
■ 凝胶浓度（%）线性DZAK度（bp）
■■0.5
0.7
1000^
800-
—30000
-12000
■ 1.0500宀-10000■ 1.2400^^7000■ 1.5200^-3000■ 2.050〜2000
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2 、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝
胶成像系统
3、试剂
(1)50 X TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g , EDTA 37.2g ,加入约800ml的去离子水，
充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L ,室温保存。
(2) 6 X电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40% ( W/V )蔗糖水溶液，贮存于4 C。
(3)溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/mL 。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
( 4)分子量标准DNA ：DNA Marker
四、操作步骤
1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml):称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1X TAE ，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0% 琼脂糖凝胶液。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的
2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
在冷却到65 C左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料(10ml:1ul ),混匀后小
心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1 x TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2伽为止。
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。
微波炉中加热时间不宜过长。
倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高（＞60 C ），会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子
浓度，影响电泳效果。
3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，
应更换一个加样头，以防污染。
加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记
下加样的顺序）。
注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽
量在加样孔中而不外溢。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V ，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下
沿约1cm 处时，停止电泳。
5、电泳完毕后，取出凝胶
6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
注意事项：
1、操作时带一次性手套，避免DNA 酶污染引起DNA 降解。
2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
3、一般情况，电泳电压＜20V/cm ,温度＜30 C；大分子量DNA链电泳，温度应＜15 C。
4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA 变性。
5、凝胶中DNA 的上量要合适，太多会引起DNA 条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA 条带。
思考题
1 、琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？
2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？。