叶绿体色素提取分离理化性质鉴定和含量测定(模)
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
过滤入三角瓶中
观察荧光现象 透射光 色，反射 光 光。
定性实验 无需移液管量 皂化反应(约1ml)
加KOH数片剧烈摇均， 加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察 上层呈 吸收 下层呈 吸收 色，为 光。 色,为 光。 ， ,
取代反应（约1mL）
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝 卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析：
称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份 0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心 5min, 上清液在 649 ， 652 ， 665 测定 OD ，计算 Chla,Chlb 和Chl总量的值。
5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红
光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量 叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 400 500 Waverlength(nm) 600 700
a
b
• 实验步骤 1．定性分析：
加醋酸约1ml，变褐 为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变 色，为 叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝ຫໍສະໝຸດ 素的吸收光谱测定：皂化反应的上层 黄色石油醚溶液 弃上层，反复用石油醚萃取,直 到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1） （稀释，665nm OD 0.5-1）
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 • Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A6521000/34.5
叶绿体色素的提取分离及其理化性质的鉴定实验
光合和呼吸代谢【模块实验目的】光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。
前者是物质合成与能量储存的过程，属于同化作用，为包括人类在内的几乎所有生物的生存提供了物质来源和能量来源，对人类和整个生物界都具有非常重要的意义；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用，为生命活动提供能量。
光呼吸是在光下绿色细胞发生吸氧与放出二氧化碳的过程，虽然在气体交换方面它与光合作用正好处于相反方向，但无论从发生部位、对光的依赖及在生化上的联系来看，都同光合作用具有很密切的关系。
本模块实验通过测定玉米种子萌发至两周内的呼吸速率。
线粒体H+-ATP酶活性、光合速率、叶片中叶绿素含量及乙醇酸氧化酶活性，了解研究植物的光合和呼吸代谢的基本方法。
【流程图】4-1叶绿体色素的提取和分离［实验目的］了解和掌握叶绿体色素提取、分离的原理和方法。
[ 实验原理]叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
他们与类囊体膜相结合成为色素蛋白复合体。
这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色谱分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可分开各种色素。
[ 器材与试剂]1. 实验仪器与用具研钵、漏斗、剪刀、滴管、圆形滤纸（直径11cm）、层析缸2. 实验试剂丙酮、甲醇、石英砂、碳酸钙、无水硫酸钠、四氯化碳、乙醚3. 实验材料玉米幼苗叶片[ 实验步骤]1. 叶绿体色素的提取：取新鲜叶片4g,洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中，研钵中加2~3ml 95%乙醇，研磨至匀浆，再加10~15ml 95%乙醇，提取3~5min，过滤，残渣用5ml 95%乙醇冲洗，合并滤液，定容至25ml。
2. 将展层用的圆形滤纸剪成2cm x20cm的纸条，其中一端剪去两侧，中间留一窄条，长约1.5cm,宽约0.54cm。
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告摘要：叶绿体是植物细胞中最重要的细胞器之一，其中的叶绿素是进行光合作用的重要色素。
本实验是研究叶绿体的色素成分，通过酒精提取和乙醚分离的方法对叶绿体中的色素进行提取和分离，通过吸收光谱分析、薄层色谱和比色法对叶绿素的化学性质进行检测。
实验结果表明，经过酒精提取和乙醚分离后，我们成功地从叶绿体中提取出了叶绿素和类胡萝卜素。
通过比色法测定叶绿素含量，结果显示样品中叶绿素的含量为0.491mg/g，与文献中报道的值相近。
薄层色谱结果显示，叶绿素的Rf值为0.197，类胡萝卜素的Rf值为0.598。
吸收光谱显示叶绿素在420nm和660nm的波长处有吸收峰。
本实验不仅可以帮助我们深入了解叶绿体的化学成分和理化性质，还有助于我们学习不同的色谱分离和检测方法。
一、实验目的1. 学习通过酒精提取和乙醚分离的方法，用于提取叶绿体中的色素，探究叶绿体的色素成分。
2. 了解叶绿素的化学性质，通过吸收光谱分析、薄层色谱和比色法，检测叶绿素的理化性质。
二、实验原理1. 叶绿体植物细胞中最重要的细胞器之一，是进行光合作用的地方。
叶绿体中最主要的色素，分为叶绿素a和叶绿素b两种，分子式C55H72O5N4Mg。
吸收光谱表现为在绿色和黄色波段有吸收峰，吸收峰位于420nm和660nm处。
3. 类胡萝卜素4. 酒精提取法通过将叶绿体与酒精混合并长时间振荡，使得叶绿体中的色素被溶解到酒精中。
5. 乙醚分离法将酒精溶液中的色素与等量的乙醚混合，色素会被乙醚除去，实现了色素的分离。
6. 比色法根据叶绿素对吸收光谱的特点，可利用比色法测定样品中叶绿素的含量。
7. 薄层色谱根据化合物在不同移动相中的极性，通过在硅胶或薄层板上分离，分离化合物的一种技术方法。
8. 吸收光谱根据吸收法原理，测定样品对特定波长的光吸收情况，从而识别和测定不同化合物的含量和种类。
三、实验步骤1. 取适量淡绿色菠菜叶片，用预冷的0.1mol/L盐酸液洗涤3次。
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定
叶绿体色素的提取分离、理化性质和含量测定1 实验目的（1）学习用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法；（2）验证叶绿体素的理化性质。
2 实验原理2.1 叶绿素的提取叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合称为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加一分离和鉴别。
2.2 叶绿素的分离薄层层析色谱法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上称一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
流动相通过毛细血管作用由下而上浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断地吸附、脱吸附、再吸附、再脱附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一点，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
2.3 叶绿素理化性质测定叶绿素是一种由叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较为稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。
去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜带叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多只植物的浸渍标本。
2.4 叶绿素含量的测定根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。
实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定
透射光下
反射光下
叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其 能量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸 收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 。
叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从 第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。
分子吸收的光能有一部分消耗 于分子内部的振动上，发射的 荧光的波长总是比被吸收光的 波长要长
2.2.3 含量测定
• 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和 645 nm；
• 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5）， 测OD652求出叶绿素a、b总量。
• 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
• 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积 ×稀释倍数]/样品鲜重
• 叶绿素的含量（mg / g）=[叶绿素的浓度×提取 液体积×稀释倍数]/样品鲜重
以样品重为3g为例: = C ×（25×50 / 5）/3 = OD652 / （34.5×3） ×（25×50 / 5）
6 注意事项
① 操作应在弱光下进行 ？ ② 研磨时间尽可能短，以不超过2分钟为宜 ③ 分光光度计的正确使用(更换波长后要调0) ④ 皂化反应最后做
亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ四个异戊二烯单位组
成的双萜，是一个亲脂的脂肪链， 它决定了叶绿素的脂溶性。
2.2 叶绿素的物理性质
2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定
2.2.1 叶绿素的吸收光谱
2.2.2 荧光现象
叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。
实验四 叶绿素提取、理化性质及含量测定
4. 叶绿素的皂化作用
3ml提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀） 3min 提取液 甲醇（ 甲醇 摇匀） + 3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀） 蒸馏水（ 蒸馏水 逐滴加，摇匀）
60℃水浴
冷却 + 3ml苯（摇匀） 苯 摇匀）
静置，观察分层现象。 静置，观察分层现象。
下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和 （以及少量的叶黄素） 下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素 和b（以及少量的叶黄素）； 上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 对照：另取 叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和 苯和2ml 蒸馏水观察与皂化 对照：另取3ml 叶绿体色素提取液，加入 的叶绿素有何不同？ 的叶绿素有何不同？ （结果与分析3） 结果与分析 ）
实验3 实验3 硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶 NR） （NR）活性的影响 存在问题： 存在问题：
设置对照的作用？ 设置对照的作用？ [NO2-]处理 对照，[NO2-] 处理-对照 B液中 3-的作用？ 液中NO 的作用？ 液中 底物，而非诱导作用。 底物，而非诱导作用。 准确分析NO3 B液-A液，准确分析 液 液
低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液， 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出 现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。 现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。
2）取代反应
卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被 等离子取代。 卟啉环中的 处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 处于不稳定的状态 稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用， 可以被 所取代而成褐色 可以被H 褐色的 稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg可以被 +所取代而成褐色的去镁叶绿 去镁叶绿素遇 则成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 深绿色的铜代叶绿素 素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本） 在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。 浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速 去镁叶绿素迅速 浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用， 被 取代，且生成的去镁叶绿素 分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。 分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。
研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。
本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。
材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。
方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。
2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。
3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。
4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。
5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。
6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。
7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。
结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。
加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。
加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。
通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。
叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。
这种反应也证实了叶绿体的存在。
叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。
叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。
乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。
这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告Array课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定姓名：专业：学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：一、实验目的和要求二、实验内容和原理三、主要仪器设备四、操作方法与实验步骤五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析七、讨论、心得一、实验目的和要求1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。
2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。
二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。
原理如下：1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。
2、皂化反应。
叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。
COOCH3COO-C32H30ON4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH+C20H39OHCOOC20H39COO-3、取代反应。
在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。
(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ )褐色绿色4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。
5、定量分析。
叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。
根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值之间有如下的关系： OD1=Ca*ka1+Cb*kb1OD2=Ca*ka2+Cb*kb2查阅文献得，叶绿素a和b的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。
波长/nm 比吸收系数k叶绿素a 叶绿素b 663 82.04 9.27645 16.75 45.60 将数值代入式子得：OD663=82.04*Ca+9.27*Cb OD645=16.75*Ca+45.60*Cb 经整理后，得到式子：Ca=0.0127 OD663 - 0.00269 OD645 Cb=0.0229 OD645- 0.00468 OD663三、主要仪器设备天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等四、操作方法与实验步骤1、定性分析：鲜叶5g+95%30ml（逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。
实验3叶绿体色素的提取、分离及理化性质的测定
实验3叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定实验三叶绿体⾊素的提取、分离及理化性质的测定【实验原理】叶绿体⾊素⼜称光合⾊素，在⾼等植物中可分为叶绿素和类胡萝⼘素两⼤类，前者包括叶绿素a（蓝绿⾊）和叶绿素b（黄绿⾊），后们类囊体膜上的蛋者包括胡萝⼘素（橙⾊）和叶黄素（黄⾊），它与⽩质结合形成⾊素蛋⽩复合体，不溶于⽔，易溶于酯，因此可⽤丙酮、⼄醇、⽯油醚等有机溶剂进⾏提取。
叶绿体⾊素的分离有多种⽅法，本实验仅介绍纸层析法。
层析的基本原理：在分离过程中，由⼀种流动相（即⼀种液体或⽓体）带动着试样经过固定相（⼀种⽀持物，如纸）向外扩散，由于试样在两相中的溶解度不同和固定相对试样中不同成分的吸附程度有别，当⽤适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过⼀定时间层析后，可使试样中的各种组分得到分离，在做纸层析时，由于纸对光合⾊素中各种⾊素分⼦的吸附程度不同，以及这些⾊素分⼦在溶剂四氯化碳（推进剂）中溶解度也有差异，以致溶剂带动⾊素分⼦向四周移动时，各种⾊素分⼦沿纸扩散的速度也就不同，使混合⾊素分离，出现不同颜⾊的环。
将提取的叶绿素溶液置于光下，在透射光呈绿⾊，在反射光下呈这现象称为荧光现象。
在反射光下叶绿素溶液之所以呈樱桃红⾊，种发态，激发态的叶樱桃红⾊，是因为叶绿⾊分⼦吸收光能后处于激状绿素分⼦很不稳定，当它回到基态时，将所获得的能量以辐射能的形式发射出红光量⼦。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光、⾼温等的破坏，特别是当叶绿素与蛋⽩质分离以后，破坏更快，⽽类胡萝⼘素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H＋所取代⽽成褐⾊的去镁叶绿素，后者遇铜后，其中的氢（H＋）⼜被铜（Cu2＋）取代，形成了铜代叶绿素，便由褐⾊转变成蓝绿⾊，铜代叶绿素很稳定，且⽐原来的绿⾊还要稳定些，在光下也不易被破坏。
设备试剂】【材料、与1. 材料新鲜的菠菜或⼩⽩菜等其他绿⾊植物叶⽚。
2. 设备电⼦天平、研钵、烧杯、量筒、培养⽫、刻度试管、试管夹、试管架、酒精灯、剪⼑、圆形滤纸、⼩漏⽃等。
叶绿体色素的提取分离和理化性质实验报告
生物学导论实验报告叶绿体色素的提取分离和理化性质一、提取与分离1、实验目的学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2、实验原理提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。
如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。
分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。
流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。
3、实验材料与试剂（1）新鲜的菠菜叶；（2）体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末、展开剂（3）钵体、漏斗、三角瓶、剪刀、点样本、毛细管、层析缸、硅胶预制板、滤纸。
4、实验步骤（1）色素提取液的制备取叶4~5片新鲜叶片，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入钵体中。
加入少量碳酸钙，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加入10ml乙醇，上清液过滤，残渣再用10ml乙醇冲洗过滤。
（2）叶绿体色素的分离取硅胶预制板一个，用点样毛细管取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，风干，重复操作3~4次；在干燥的层析缸中加入适量展开剂，高度0.5cm，将硅胶预制板带有色素一端放入，使其下端浸入展开剂中；当色素较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板的上端边缘时，取出，画线。
Rf=斑点中心到原点距离/溶剂前沿到原点距离5、实验结果与分析从上至下为胡萝卜素（橙色）：Rf=6.95/7.35=0.946叶绿素a（蓝绿色）：Rf=5.35/7.35=0.728叶绿素b（黄绿色）：Rf=4.95/7.35=0.673叶黄素（黄色）：Rf=4.10/7.350.558可知，胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素极性依次增大，与硅胶吸附能力依次增强。
叶绿体色素实验
叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定实验一、叶绿体色素的提取、分离1.实验名称叶绿体色素的提取、分离实验2.实验原理叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。
本实验采用酒精提取。
层析法原理： K=Cs/Cm。
3.实验试剂与材料新鲜菠菜叶体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1）天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸4.实验步骤1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。
（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，待干后再次划线，重复3,4次。
在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。
改好缸盖。
待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。
5.实验结果与分析滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是：橙黄色胡萝卜素（最快）黄色叶黄素蓝绿色叶绿素a（最多）黄绿色叶绿素b（最慢）二.理化性质1.实验目的验证叶绿素的理化性质。
2.实验原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
实验4叶绿素的提取、理化性质和含量测定
5 结果记录与数据处理
5.1 实验现象记录与分析
表1 叶绿素的理化性质
荧光现象
颜色变化/分层
原理
取代反应—醋酸 — CuAc —浓HCl
皂化反应—上层 —中层 —下层
5.2 叶绿素含量计算与分析
• 叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
2. 实验原理
2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质
• 吸收光谱 • 荧光现象
2.3 叶绿素的化学性质
• 取代反应 • 皂化反应
2.1 用含水的有机溶 剂提取叶绿素
亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带
正电性，与其相联的氮原子则偏向 于带负电性，因而卟啉具有极性， 是亲水的，可以与蛋白质结合。
透射光下
反射光下
叶绿体吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体（LHC），LHC将其 能量传递到PSII或PSI。其间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸 收的光能被重新发射出来，其波长较长,也即叶绿素荧光 。
叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从 第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。
分子吸收的光能有一部分消耗 于分子内部的振动上，发射的 荧光的波长总是比被吸收光的 波长要长
2.3 叶绿素的化学性质
2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应
2.3.1 叶绿素 的结构
• 叶绿素a与b很 相似，不同之 处仅在于Chla 第二个吡咯环 上的一个甲基 (-CH3)被醛基 (-CHO)所取代 即Chlb。
2.3.2 取代反应
叶绿体色素的提取分离理化性质鉴定及含量测定
内容：
①叶绿素a和b含量差异； ②绿色素与黄色素的含量差异
色素提取分离的原理; 叶绿素测定的方法及其原理； 绿色素与黄色素的纯化原理及步骤； 叶绿素的理化性质的鉴定方法
实验原理
Photosynthesis
Thermosynechococcus
elongatus(蓝细菌)
研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、 试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。 • 试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、 碳酸钙、石英砂等
实验步骤
鲜叶4 g，加丙酮10 ml及少许碳酸
1
钙和石英砂，匀浆，以漏斗过滤之
再加丙酮20 ml洗并过滤，即为色素提取液。放于暗处备用。
取少许于另 3 一试管中
实验步骤 叶绿素a和b的测定
鲜叶0.5 g，加丙酮5 ml及少许碳酸钙和石英砂，匀浆，将 匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮 定容至10ml
吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用
取上述色素提取液4ml，以80%丙酮为对照，分别测定 663nm、645nm和 440nm处的光密度值。
Ca=12.7 OD663-2.69 OD645
（3）
Cb=22.9 OD645-4.68 OD663
（4）
CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645
பைடு நூலகம்
• Ck=4.7OD440- 0.27Ca+b
（5）
叶绿体色素的理化性质
（1）叶绿素与类胡萝卜素都有一定的吸收光谱， 可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；
第二单线 态10-12 S
叶绿体色素的提取理化性质与含量测定
2）取代反应
卟啉环中旳Mg处于不稳定旳状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。 稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg能够被H+所取代而成褐色旳去镁叶绿 素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色旳铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。
7. 思索题
1）用不含水旳有机溶剂提取植物材料尤其是干材料旳叶绿 体色素往往效果不佳，原因何在？
2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？ 3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸
收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b旳定量分析？为何？
加入少许碳酸钙旳目旳是为了预防在研磨过程中，叶绿素受到破坏。 详细旳情况是这么旳：叶绿体中旳色素所处旳环境具微碱性，试验中， 因为研磨会使细胞构造遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性旳 细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素旳分子构造遭到破坏， 使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液旳 酸性，可起到保护叶绿素旳作用 。
5. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+旳取代作用
1）吸收叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇 匀，观察溶液颜色旳变化。 （成果与分析4.1）
2）当溶液变褐色后，倾出二分之一于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉， 水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同步加热）旳一管相比 较。（成果与分析4.2）
试验 叶绿体色素旳提取、理化性 质与含量测定
1. 试验目旳及意义
➢ 提取叶绿体色素 ➢ 分析叶绿素旳物理、化学性质 ➢ 测定叶绿素旳含量 ➢ 提取和测定植物组织中旳光合色素是研究光
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告
叶绿体色素的提取分离及理化性质检测实验报告一、实验目的：1. 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。
2. 了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。
二、实验原理：叶绿体是进行光合作用的细胞器。
叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。
这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。
提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。
薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。
由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。
植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。
本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。
三、实验材料与试剂：1. 新鲜的菠菜叶片。
2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂〈石油醚：丙酮：苯=75：1，体积比>。
3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。
四、实验步骤：(一) 色素提取液的制备1. 取新鲜叶片4“5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。
2. 向研钵中加入少量CaCO₃**,再加2*3ml体积分数为 95%的乙醇,充分研磨至糊状，再加10°15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出。
残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。
提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验(如后面的叶绿素理化性质的验证)。
(二) 叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。
实验3 叶绿体色素的提取、分离、性质
实验三叶绿体色素的提取、分离、性质及含量一、实验目的1、掌握叶绿体色素的提取方法；2、掌握纸层析法分离叶绿体色素的原理和步骤；3、掌握叶绿体色素的部分理化性质。
二、实验原理叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体，这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。
因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。
叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光光度计精确测定。
叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。
叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。
叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验仪器及材料仪器及试剂：吹风机、定性滤纸、脱脂棉、火柴、碘钨灯、95%乙醇、汽油、醋酸铜、浓盐酸、CaCO3材料：菠菜叶片四、实验步骤1、提取称菠菜叶子10g，加少许石英砂、CaCO3、乙醇研磨，研成匀浆，过滤，用乙醇定容至50ml，分装于5个试管内。
2、分离用滤纸条浸色素提取液（试管1），吹干，反复多次；将带色素的滤纸条卷成灯芯，将表面皿放在培养皿内，注上汽油，把灯芯浸在汽油内，加盖，色素层分清后，取下吹干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。
用铅笔标出各种色素的位置和名称。
3、叶绿体色素吸收光谱曲线取1ml提取液于比色杯中（试管2），加3ml95%乙醇。
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静置约10min 加蒸馏水约10ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层
分别收集并保存于试管中
实验步骤
5 观察色素溶液的吸收光谱
(1)调节分光计，观察电灯光的光谱； (2)观察色素丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释1倍比较之； (3)观察黄色素乙醚溶液，用乙醚将溶液稀释1倍比较之； (4)观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释1倍比较 之； （今天选择做） (5)观察铜代叶绿素溶液。 （今天选择做）
Thermosynechococcus
elongatus(蓝细菌)
PS I
Байду номын сангаас
PS II
z光合色素的脂溶性----- 酒精、丙酮等有机溶剂提取
zChl是双羧酸的酯---皂化反应---叶绿素与类胡萝卜素 分离
zChl的取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn 2+取代
光学特性：
• Chla Chlb有两个强吸收峰----含量测定时选择叶绿素 特有的红光吸收峰波长；
叶绿体色素的提取、分离、理 化性质鉴定及含量测定
实验目的：分析校园中两种植物 材料叶绿体色素的差异
内容：
①叶绿素a和b含量差异； ②绿色素与黄色素的含量差异
色素提取分离的原理; 叶绿素测定的方法及其原理； 绿色素与黄色素的纯化原理及步骤； 叶绿素的理化性质的鉴定方法
实验原理
Photosynthesis
（2）叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光； （3）叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光破
坏； （今天选择做） （4）叶绿素中的镁可被H+取代而成褐色的去镁
叶绿素；加入铜盐作用，后者则成为绿色的 铜代叶绿素。
实验材料和器材
• 实验材料：（两组组合，每组做一种植物材 料，最后两组结果放在一起分析）
• 器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、
研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、 试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。 • 试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、 碳酸钙、石英砂等
实验步骤
鲜叶4 g，加丙酮10 ml及少许碳酸
1
钙和石英砂，匀浆，以漏斗过滤之
再加丙酮20 ml洗并过滤，即为色素提取液。放于暗处备用。
取少许于另 3 一试管中
取3 ml于另 一试管中 2
1滴1滴加浓盐酸，直
5
至溶液出现褐绿色
4 取20 ml
用于绿色素与 黄色素的分离
加醋酸铜晶体少许，慢慢加热 溶液，则又产生鲜亮的绿色
分别观察在反射光和透射光一 侧，提取液的颜色有无不同 ； 观察色素溶液的吸收光谱
实验步骤 绿色素与黄色素的分离
取20 ml色素提取液加到盛有20 ml乙醚的分液漏斗中，摇动 沿漏斗边缘加入30 ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗， 静止10分钟，溶液即分为两层。弃去下层水相； 再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1次，弃去下层水相。
实验步骤 叶绿素a和b的测定
鲜叶0.5 g，加丙酮5 ml及少许碳酸钙和石英砂，匀浆，将 匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮 定容至10ml
吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用
取上述色素提取液4ml，以80%丙酮为对照，分别测定 663nm、645nm和 440nm处的光密度值。
• 纸层析方法：根据色素在不同有机溶剂中的 溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同 ，可将它们彼此分离开。 （定性，小量）（ 今天选择做）
• 皂化反应和萃取分离方法 （大量，定量）
叶绿素a和b含量的测定方法—分光光度法
• 根据Lambert-Beer定律 ： OD1=Ca·ka1+Cb·kb1 （1） OD2=Ca·ka2+Cb·kb2 （2）
按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、 叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度，类胡萝卜素浓度。再根据稀释 倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。
注意事项
• 实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要 远离火源。尤其注意做铜代反应时避免伤 人。
• 研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研 磨时四处飞溅。
• 叶绿素要避光保存。
实验作业
1 按照规范写出实验报告，以两组结果比较进行结果 分析与讨论。
2.色素分离开始三次加蒸馏水的目的是什么，加乙醚 的作用又是什么？
下次实验内容 1 和教师讨论自己的方案的最后时间节点
2 选择学习光合强度的测定
第二单线 态10-12 S
第一单线 态10-9 S
能 量
基态
680nm 670nm
430nm
能热
分子内能量传
递
吸
吸
收
收
热
传向反应中 心
荧能
光
光光
三线态
磷 光
热 能
10-3~10-2 S
Chl的荧光和磷光现象----反射光中 能观察到呈红色的荧光； 叶绿素化学性质不稳定，光容易受 强光的破坏
叶绿体色素的分离方法
Ca=12.7 OD663-2.69 OD645
（3）
Cb=22.9 OD645-4.68 OD663
（4）
CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 （5）
• Ck=4.7OD440- 0.27Ca+b
叶绿体色素的理化性质
（1）叶绿素与类胡萝卜素都有一定的吸收光 谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测 定；