3、毒理学第三讲 长期毒性试验

功，是其它实验动物不可替代的。
•包括猕猴在内的非人灵长类与人类的遗传物质有 75%~98.5%的同源性，显示了许多相
似的生物学和行为学wenku.baidu.com征，成为解决人类健康问题的疾病问题的基础研究和临床前研究
的理想动物模型。

实验动物按微生物控制标准的分级
一级 普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病
高剂量组：足以引起明显的或严重的毒性反应，但又不能造成太多动物中毒死亡，死亡率应 控制在 10%以内的剂量； 低剂量组：不引起毒性作用的剂量； 中间剂量组：为表明毒性作用的量-效关系，在上述两个剂量之间按照一定的倍比关系至少 插入一个中间剂量组。 溶剂对照组：给予与高剂量组相同体积的溶剂。 在选择合适的剂量时还应考虑到：（p154）
慢性毒性试验 年龄：大鼠 50~70g
狗<8 月 小鼠初断乳 数量：小动物≥40 大动物≥8 性别：雌雄各半
4、动物的饲养管理 •温度：啮齿类动物 18～27℃（70～72°F） •湿度：相对湿度为 40～70％。空气中水分太少，动物的粘膜和眼睛易干燥，湿度太大，
又适宜细菌和真菌生长，容易造成动物呼吸道和皮肤等处感染，尿液和排泌物不易蒸发干， 增加饲养室内的异味；
大白鼠
2.5
3
＞3
家兔
6
7
＞7
狗
10
12
＞12
猴
15
18
＞18
2.给药的剂量范围不同
长期毒性试验的给药剂量比急性毒性要小得多。
--急性毒性试验为一次性大剂量给药；长期毒性试验为低剂量长期积累。
急性试验无毒的药物，长期反复给药后，虽然在较低的剂量水平，但是由于量与质上的
积累作用，可能会导致生理内环境的紊乱，产生毒性反应。
低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值； 5、研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性； 6、探讨可能的毒作用机制； 7、确定不同动物物种对受试物长期毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依
据。
第二节 长期毒性试验设计
一、一般原则和要求
1.剂量组：至少高、中、低三个剂量组，高剂量组应充分反映药物的毒性，低剂量组不
•猕猴
•猕猴（Rhesus monkey；Macaca mulatta Zimmermann）属哺乳纲，灵长目，猴科，猕猴
属动物。
•猕猴是猕猴属猴的总称，共有 12 个种系，其中恒河猴分布最广，数量最多，应用最广，
猕猴作为灵长类动物，是人类的近属动物，在组织结构、生理和代谢功能等方面同人类
相似，最易解决人类相似的疾病及其发病机制，有些人类疾病只有用猕猴做实验才能成
给药所造成的有害反应及量效关系。
二、实验动物选择
1.动物的品种和品系
两种种属的动物
啮齿类：大鼠、小鼠、豚鼠或家兔
非啮齿类：犬、猴
根据不同接触途径和试验要求，选择不同的物种。原则：对受试药物敏感；与人体的生
物转化相近；易于获得且便于饲养和管理；毒理学研究背景资料较多。
•SD 大鼠
•生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。
原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。用于教学。
二级 清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。用于一般动物
实验。
三级 无特殊病原体动物（Specific Pathogen free, SPF)，要求到二级外，还要排除一些规定
的病原体。
四级 无菌动物（Germ free, GF），要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。此类动
①供试药物在体内的生物蓄积作用：测定有关的蓄积参数，有助于了解药物的蓄积性。 对于高蓄积性药物应适当减少剂量； ②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供 试药物本身所诱导或抑制。例如，某些药物如果抑制与其本身代谢或解毒有关的酶，则 该药物的给药剂量应酌情减少。 ③供试物在消化道中的稳定性，与胃肠道内容物有亲和性的药物，应酌情增加剂量。
补充 蓄积毒性试验方法及其评价 •化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性 是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的 主要依据。 •蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数 K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供 参考。
蓄积系数(accumulation coefficient)
是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出 现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：
K＝ED50(n)/ED50(1) K＝LD50(n)/LD50(1)
表 蓄积系数分级标准
蓄积系数（K）
3) 年龄较大的动物反应性降低，存在较多自发性疾病干扰试验结果。
•大鼠：4~9 周龄 beagle 犬：4~9 月龄（6 月）
•动物的起始体重应在平均体重的 20%范围之内
3、性别与数量
亚慢性毒性试验 年龄：大鼠 80~100g
狗 8~12 月 小鼠 10~15g 数量：小动物≥20 大动物≥6 性别：雌雄各半
•光照： 持续 12 小时明亮，12 小时黑暗，有利于刺激动物甲状腺激素、促肾上腺皮质 激素和生长激素的分泌；
•通风条件： •饮水质量：
•饲料配方：所用饲料应符合动物的营养标准，若用自已配制的饲料，应提供配方及营养 成分含量的检测报告，若是购买的饲料，应注明生产单位。
•大鼠雌雄应分开饲养，每笼不宜超过 5 只，实验前至少饲养观察一周。 •狗要求单笼饲养，定量喂食，Beagle 狗实验前至少训养 1～2 周；杂种狗应先检疫，打 预防针，驱虫，实验前训养 3～4 周，观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、 心电图，检测心、肝、肾功能两次，选择正常、健康、雌性无孕的动物作为受试动物。 三、给药期限
物系在无菌条件下剖宫产出，又饲养在无菌、恒温、恒湿的隔离屏障内。
五级 悉生动物（Gnorobiotic animal,GN），在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。
2、起始月（周）龄
多选择较年轻或正处于生长发育阶段的动物，原因：
1) 长期试验的给药期限较长；
2) 处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；
蓄积毒性作用的分类
物质蓄积(material accumulation)：指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内
逐渐积累。可以用一定的分析方法测得体内该化合物或其代谢产物的增加过程。这种蓄积随
着时间延长而含量增加,当达到中毒阈值时而产生毒性作用。
功能蓄积(functional accumulation)：指机体少量反复多次接触毒物，每次引起的轻微功 能损害逐渐蓄积，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时用检测手段却查不出机体内毒 物的存在或增加。 3.所观察的毒效应不同
急性毒性试验；以死亡为效应的质反应过程； 长期毒性试验：一般毒性的量反应指标，如体重、摄食量、血液学、血液生化指标等
四、长期毒性试验的试验目的 1、发现在急性毒性试验中未发现的毒作用，为受试物的毒作用研究提供新的信息； 2、描述毒反应的性质和程度； 3、研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官； 4、研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量—反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最
•该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及
GLP 实验。
•比格犬（Beagle）
来源：原产英国，是猎犬中较小的一种。由于体型适中、性情温顺、遗传性状稳定、实
验结果重复性好、适应性强等优点，被广泛应用于生命科学领域。在以犬为实验动物的研究
成果中，只有应用 Beagle 才能被国际公认。
蓄积毒性作用
药物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物
反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度
(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学
毒物的蓄积作用 (accumulation) 。
长期毒性作用及其试验方法
第一节 基本概念和目的
一、定义：药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物的有害作用，为观察这种有害作 用而设计的毒理学试验称之为长期毒性试验。
二、分类
长期毒性试验： （根据给药期限长短）
亚慢性毒性试验 慢性毒性试验 终生毒性试验/数代毒性试验
亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源 化合物所引起的毒性效应。 慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒 物所产生的毒性效应。 •一般地说，亚慢性毒性试验给药期限不超过 90 天或不超过试验动物平均寿命的 10％； •凡超过 90 天或平均寿命 10％的都可认为是慢性毒性试验。
出现毒性反应。同时应设溶剂或者已知药物的毒性对照组。
2.动物：应是年轻健康、来源清楚，对药物敏感、与人类代谢相类似的动物。
3.给药途径：与临床拟用途径一致。
4.观察指标：应能反映实验动物功能及结构的完整性是否受到损害。
一般是以药政部门的技术要求规范为核心，同时兼顾给药时限和给药剂量这两个重要因
素，对整个长期毒性试验做一个较为合理的安排和设计，力争高效率、全面地了解药物长期
行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。 此时，计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算 K 值，进行评价。但若接触剂量已累积 达到 5 个 LD50 剂量，也可终止试验。 2.剂量递增法：
在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算 K 值进行评价。 一般来说，在试验第 2l 天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半， 说明其累积剂量已达 5.26LD50，即 K＞5。
使用本方法时要注意染毒期间定期(每 4 天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒 物的染毒绝对量。 3.剂量固定的 20 天蓄积法：
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为 5 个组，包括阴性对照组和 1/20 LD50、 l/10 LD50、1/5 LD50 和 1/2 LD50 四个剂量组，每组动物数 10 只，雌雄各半。每日染毒一次， 连续染毒 20 天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。
•工业毒理学——3－6 个月 •食品毒理学——6 个月~1 年 •环境毒理学——6 个月~1 年 •药物毒理学——临床疗程的 3~4 倍 •致癌试验——接近或等于动物的预期寿命 创新药物试验周期不少于 90 天，超过 180 天的新药可以在试验开始 90 天后同时进行 I 期临床试验。 （p153 表 14-2 我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定） 四、剂量水平的选择
亚慢性毒性的剂量选择 •阴性对照组 •低剂量组 •中剂量组 •高剂量组 急性毒性的阈剂量 1/20~1/5LD50 •组距：3~10 倍，最低不小于 2 倍
慢性毒性的剂量选择 •阴性对照组 •低剂量组 •中剂量组 •高剂量组 亚慢性阈剂量或其 1/5~1/2、1/10LD50 •组距：2~5 倍，最低不小于 2 倍
蓄积毒性分级
＜1
高度蓄积
1~
明显蓄积
3~
中等蓄积
5~
轻度蓄积
1.固定剂量法： 常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出 LD50，然后选取相同条件的 40
只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少 20 只，雌雄各半。 试验组在 1/20～l/50LD50 的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进
试验结束时根据下列标准进行评定： ①蓄积性不明显：各剂量组均无死亡； ②弱蓄积性：仅 1/2LD50 剂量组有死亡，其他组均无死亡； ③中等蓄积性：1/20LD50 剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系； ④强蓄积性：1/20LD50 剂量组有死亡，且有剂量反应关系。
三、长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异
1.给药的期限不同
急性毒性试验为一次性给药或 24h 内多次给药。
长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药，给药期限可以从数天至终生甚至数代，一
般为临床用药的 3-4 倍。
表 3-1 常用实验动物的平均寿命及长期毒性试验给药期限
试验动物 平均寿命（年） 亚慢性试验给药期限（月） 慢性试验给药期限（月）