3、毒理学第三讲 长期毒性试验

•猕猴
•猕猴（Rhesus monkey；Macaca mulatta Zimmermann）属哺乳纲，灵长目，猴科，猕猴
属动物。
•猕猴是猕猴属猴的总称，共有 12 个种系，其中恒河猴分布最广，数量最多，应用最广，
猕猴作为灵长类动物，是人类的近属动物，在组织结构、生理和代谢功能等方面同人类
相似，最易解决人类相似的疾病及其发病机制，有些人类疾病只有用猕猴做实验才能成
高剂量组：足以引起明显的或严重的毒性反应，但又不能造成太多动物中毒死亡，死亡率应 控制在 10%以内的剂量； 低剂量组：不引起毒性作用的剂量； 中间剂量组：为表明毒性作用的量-效关系，在上述两个剂量之间按照一定的倍比关系至少 插入一个中间剂量组。 溶剂对照组：给予与高剂量组相同体积的溶剂。 在选择合适的剂量时还应考虑到：（p154）
蓄积毒性作用
药物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物
反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度
(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学
毒物的蓄积作用 (accumulation) 。
慢性毒性试验 年龄：大鼠 50~70g
狗<8 月 小鼠初断乳 数量：小动物≥40 大动物≥8 性别：雌雄各半
4、动物的饲养管理 •温度：啮齿类动物 18～27℃（70～72°F） •湿度：相对湿度为 40～70％。空气中水分太少，动物的粘膜和眼睛易干燥，湿度太大，
又适宜细菌和真菌生长，容易造成动物呼吸道和皮肤等处感染，尿液和排泌物不易蒸发干， 增加饲养室内的异味；
•光照： 持续 12 小时明亮，12 小时黑暗，有利于刺激动物甲状腺激素、促肾上腺皮质 激素和生长激素的分泌；
•通风条件： •饮水质量：
•饲料配方：所用饲料应符合动物的营养标准，若用自已配制的饲料，应提供配方及营养 成分含量的检测报告，若是购买的饲料，应注明生产单位。
•大鼠雌雄应分开饲养，每笼不宜超过 5 只，实验前至少饲养观察一周。 •狗要求单笼饲养，定量喂食，Beagle 狗实验前至少训养 1～2 周；杂种狗应先检疫，打 预防针，驱虫，实验前训养 3～4 周，观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、 心电图，检测心、肝、肾功能两次，选择正常、健康、雌性无孕的动物作为受试动物。 三、给药期限
亚慢性毒性的剂量选择 •阴性对照组 •低剂量组 •中剂量组 •高剂量组 急性毒性的阈剂量 1/20~1/5LD50 •组距：3~10 倍，最低不小于 2 倍
慢性毒性的剂量选择 •阴性对照组 •低剂量组 •中剂量组 •高剂量组 亚慢性阈剂量或其 1/5~1/2、1/10LD50 •组距：2~5 倍，最低不小于 2 倍
蓄积毒性分级
＜1
高度蓄积
1~
明显蓄积
3~
中等蓄积
5~
轻度蓄积
1.固定剂量法： 常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出 LD50，然后选取相同条件的 40
只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少 20 只，雌雄各半。 试验组在 1/20～l/50LD50 的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进
试验结束时根据下列标准进行评定： ①蓄积性不明显：各剂量组均无死亡； ②弱蓄积性：仅 1/2LD50 剂量组有死亡，其他组均无死亡； ③中等蓄积性：1/20LD50 剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系； ④强蓄积性：1/20LD50 剂量组有死亡，且有剂量反应关系。
•该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及
GLP 实验。
•比格犬（Beagle）
来源：原产英国，是猎犬中较小的一种。由于体型适中、性情温顺、遗传性状稳定、实
验结果重复性好、适应性强等优点，被广泛应用于生命科学领域。在以犬为实验动物的研究
成果中，只有应用 Beagle 才能被国际公认。
大白鼠
2.5
3
＞3
家兔
6
7
＞7
狗
10
12
＞12
猴
15
18
＞18
2.给药的剂量范围不同
长期毒性试验的给药剂量比急性毒性要小得多。
--急性毒性试验为一次性大剂量给药；长期毒性试验为低剂量长期积累。
急性试验无毒的药物，长期反复给药后，虽然在较低的剂量水平，但是由于量与质上的
积累作用，可能会导致生理内环境的紊乱，产生毒性反应。
给药所造成的有害反应及量效关系。
二、实验动物选择
1.动物的品种和品系
两种种属的动物
啮齿类：大鼠、小鼠、豚鼠或家兔
非啮齿类：犬、猴
根据不同接触途径和试验要求，选择不同的物种。原则：对受试药物敏感；与人体的生
物转化相近；易于获得且便于饲养和管理；毒理学研究背景资料较多。
•SD 大鼠
•生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。
功，是其它实验动物不可替代的。
•包括猕猴在内的非人灵长类与人类的遗传物质有 75%~98.5%的同源性，显示了许多相
似的生物学和行为学特征，成为解决人类健康问题的疾病问题的基础研究和临床前研究
的理想动物模型。

实验动物按微生物控制标准的分级
一级 普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病
原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。用于教学。
二级 清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。用于一般动物
实验。
三级 无特殊病原体动物（Specific Pathogen free, SPF)，要求到二级外，还要排除一些规定
的病原体。
四级 无菌动物（Germ free, GF），要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。此类动
使用本方法时要注意染毒期间定期(每 4 天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒 物的染毒绝对量。 3.剂量固定的 20 天蓄积法：
通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为 5 个组，包括阴性对照组和 1/20 LD50、 l/10 LD50、1/5 LD50 和 1/2 LD50 四个剂量组，每组动物数 10 只，雌雄各半。每日染毒一次， 连续染毒 20 天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。
长期毒性作用及其试验方法
第一节 基本概念和目的
一、定义：药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物的有害作用，为观察这种有害作 用而设计的毒理学试验称之为长期毒性试验。
二、分类
长期毒性试验： （根据给药期限长短）
亚慢性毒性试验 慢性毒性试验 终生毒性试验/数代毒性试验
亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源 化合物所引起的毒性效应。 慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒 物所产生的毒性效应。 •一般地说，亚慢性毒性试验给药期限不超过 90 天或不超过试验动物平均寿命的 10％； •凡超过 90 天或平均寿命 10％的都可认为是慢性毒性试验。
3) 年龄较大的动物反应性降低，存在较多自发性疾病干扰试验结果。
•大鼠：4~9 周龄 beagle 犬：4~9 月龄（6 月）
•动物的起始体重应在平均体重的 20%范围之内
3、性别与数量
亚慢性毒性试验 年龄：大鼠 80~100g
狗 8~12 月 小鼠 10~15g 数量：小动物≥20 大动物≥6 性别：雌雄各半
补充 蓄积毒性试验方法及其评价 •化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性 是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的 主要依据。 •蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数 K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供 参考。
低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值； 5、研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性； 6、探讨可能的毒作用机制； 7、确定不同动物物种对受试物长期毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依
据。
第二节 长期毒性试验设计
一、一般原则和要求
1.剂量组：至少高、中、低三个剂量组，高剂量组应充分反映药物的毒性，低剂量组不
三、长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异
1.给药的期限不同
急性毒性试验为一次性给药或 24h 内多次给药。
长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药，给药期限可以从数天至终生甚至数代，一
般为临床用药的 3-4 倍。
表 3-1 常用实验动物的平均寿命及长期毒性试验给药期限
试验动物 平均寿命（年） 亚慢性试验给药期限（月） 慢性试验给药期限（月）
行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。 此时，计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算 K 值，进行评价。但若接触剂量已累积 达到 5 个 LD50 剂量，也可终止试验。 2.剂量递增法：
在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算 K 值进行评价。 一般来说，在试验第 2l 天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半， 说明其累积剂量已达 5.26LD50，即 K＞5。
物系在无菌条件下剖宫产出，又饲养在无菌、恒温、恒湿的隔离屏障内。
五级 悉生动物（Gnorobiotic animal,GN），在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。
2、起始月（周）龄
多选择较年轻或正处于生长发育阶段的动物，原因：
1) 长期试验的给药期限较长；
2) 处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；
急性毒性试验；以死亡为效应的质反应过程； 长期毒性试验：一般毒性的量反应指标，如体重、摄食量、血液学、血液生化指标等
四、长期毒性试验的试验目的 1、发现在急性毒性试验中未发现的毒作用，为受试物的毒作用研究提供新的信息； 2、描述毒反应的性质和程度； 3、研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官； 4、研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量—反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最
①供试药物在体内的生物蓄积作用：测定有关的蓄积参数，有助于了解药物的蓄积性。 对于高蓄积性药物应适当减少剂量； ②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供 试药物本身所诱导或抑制。例如，某些药物如果抑制与其本身代谢或解毒有关的酶，则 该药物的给药剂量应酌情减少。 ③供试物在消化道中的稳定性，与胃肠道内容物有亲和性的药物，应酌情增加剂量。
出现毒性反应。同时应设溶剂或者已知药物的毒性对照组。
2.动物：应是年轻健康、来源清楚，对药物敏感、与人类代谢相类似的动物。
3.给药途径：与临床拟用途径一致。
4.观察指标：应能反映实验动物功能及结构的完整性是否受到损害。
一般是以药政部门的技术要求规范为核心，同时兼顾给药时限和给药剂量这两个重要因
素，对整个长期毒性试验做一个较为合理的安排和设计，力争高效率、全面地了解药物长期
•工业毒理学——3－6 个月 •食品毒理学——6 个月~1 年 •环境毒理学——6 个月~1 年 •药物毒理学——临床疗程的 3~4 倍 •致癌试验——接近或等于动物的预期寿命 创新药物试验周期不少于 90 天，超过 180 天的新药可以在试验开始 90 天后同时进行 I 期临床试验。 （p153 表 14-2 我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定） 四、剂量水平的选择
蓄积毒性作用的分类
物质蓄积(material accumulation)：指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内
逐渐积累。可以用一定的分析方法测得体内该化合物或其代谢产物的增加过程。这种蓄积随
着时间延长而含量增加,当达到中毒阈值时而产生毒性作用。
功能蓄积(functional accumulation)：指机体少量反复多次接触毒物，每次引起的轻微功 能损害逐渐蓄积，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时用检测手段却查不出机体内毒 物的存在或增加。 3.所观察的毒效应不同
蓄积系数(accumulation coefficient)
是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出 现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：
K＝ED50(n)/ED50(1) K＝LD50(n)/LD系数（K）