补充蛋白质理化性质

应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通 过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质 的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
（二）根据溶解度差别纯化的方法
影响蛋白质溶解度的外界因素主要有： （1）溶液的pH， （2）离子强度[I]， （3）介电常数ɛ， （4）温度T。
溶 液
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
带负电荷的蛋白质
沉 淀 脱水作用
脱水作用
脱水作用
作 用 示
++ +
+
碱
+
意
+
图
++
－－
酸－
－
－wenku.baidu.com
－－ －
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
蛋白质的聚沉
使蛋白质沉淀的方法
(1) 盐析法( salting out)
——向蛋白质溶液中加入大量中性盐 使蛋白质沉淀称为盐析。 •常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、 氯化钠等
（二）一般原则
1、总目标
（1）增加制品的纯度（purity）或比活 性（specific activity）即增加单位蛋白质 重量中目标蛋白质的含量或生物活性；
（2）并且使目标蛋白质的产量达到最高 值。
2、分离提纯的一般程序
含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体
前处理
可溶性蛋白质混合物抽提液
盐析原理示意图
应用
盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好 了一步即能去大量的杂蛋白。 现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已经利用 盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋 白酶等。 优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解
卵清蛋白的分离
鸡蛋清 半饱和(NH4)2SO4
球蛋白沉淀
滤液 全饱和(NH4)2SO4
◆ 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质， 需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品；
◆ 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯 到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要 尽量避免因变性而失活；
◆ 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质 提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗 性质的成分除去。
二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
（一）胶体性质 蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于
1～100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎
运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。
•胶体系统保持稳定的三个因素 ✓颗粒大小在1～100nm范围内 ✓颗粒表面带有同种净电荷 ✓与水形成水化层
（二）蛋白质的沉淀
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至 蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出的 现象称为蛋白质的沉淀。
交联葡聚糖凝胶 Sephadex
琼脂糖凝胶 Sepharose
聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-gel P）
以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰 胺（单体）聚合而成
(2)凝胶过滤的原理
凝胶过滤的原理：
当含有各种组分的样品 流经凝胶层析柱时，大分子 物质由于分子直径大，不易 进入凝胶颗粒的微孔，沿凝 胶颗粒的间隙以较快的速度 流过凝胶柱。而小分子物质 能够进入凝胶颗粒的微孔中， 向下移动的速度较慢，从而 使样品中各组分按相对分子 质量从大到小的顺序先后流 出层析柱，而达到分离的目 的。
根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述 外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物 中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的 一种手段。
1. 等电点沉淀和pH控制
利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白 质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯 化的方法称为等电点沉淀法。
在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除 了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质 仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法 经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。
单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距 较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要 一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。
2. 盐溶和盐析
盐溶(salting in) 是指低浓度的中性盐 可以增加蛋白质溶解度的现象。
盐析(salting out) 是指当中性盐的离子 强度增加到足够高时，（如饱和或半饱 和的程度），很多蛋白质可以从水溶液 中沉淀出来的现象。 常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等
•作用原理: 盐离子与水的亲和力极强，可脱去蛋白
分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分 子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。
•特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。
(2) 有机溶剂沉淀法
• 原理:
使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常 数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分 子聚集沉淀。 •常用有机溶剂: 甲醇、乙醇、丙酮
盐溶原理示意图
盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子 后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质 分子与水分子之间的相互作用却加强。
盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐 使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水 转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极 性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白 质分子表面的水化层。
•缺点：常使蛋白质变性失活。
(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法
• 原理:
生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)， 某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨 酸和硝酸等)与带正电的蛋白质结合生成 不溶性的盐而沉淀。
•缺点： 常引起蛋白质变性 •注意事项: 反应溶液的pH<pI，确保蛋
白质以阳离子形式存在
（5）加热变性
常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 是由线型的α-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙 烷反应而成,商品名为Sephadex 。
聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP) 是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共 聚而成，商品名为Bio-Gel P。
琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A) 是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose 或Bio-Gel A
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸 残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成 带负电荷或正电荷的基团。
蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数 目以及溶液的pH。
2. 等电点：使蛋白质分子所带的正电荷与负电荷
恰好相等，净电荷为零的溶液pH。（与AA相同）
每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完
全，最迅速。 原理：
1、蛋白质天然结构解体，疏水基外露， 破坏了蛋白质的水化层 2、破坏电荷情况
三 蛋白质分离纯化的一般原则
（一） 纯化的目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原
则
（一）目标
蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形 式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋 白质，必须将其分离提纯到一定的水平。
（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration) 2 凝胶过滤(gel filtration)
1 透析和超滤
* 透析(dialysis)
利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋 白质大分子与其他小分子物质分开的方法。
* 超滤法
应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透 膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩或脱盐\粗 分级的目的。
卵清蛋白晶体
3. 有机溶剂分级法
与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白 质在水中的溶解度显著降低， 原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表 面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进 了蛋白质分子的聚集沉淀； 原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺 水化水，致使蛋白质聚集沉淀。
有机溶剂分级分离原理示意图
蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:
3. 等离子点
蛋白质的等电点在有中性盐（Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-）存在下可 以发生明显的变化。
等离子点：蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中， 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受 体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。
等离子点是一个特征常数
■ 电
-
+
泳
滤纸电泳 Cellulose
形
Protein
式
Denatured
的
演
薄层电泳 (TLE) Cellulose acetate
进
Partial Denatured
胶体 Starch → Gel
圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。
—
-
+
+
纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电 泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋 白质纯度检验方法，也可以纯化、制备 蛋白质。
粗分级分离
已除去大量杂质的蛋白质浓缩液
细分级分离
高纯度的蛋白质制品
前
生物组织
处
破碎、抽提、差速离心
理
无细胞提取液
粗
分 离
选择性沉淀法
电泳
离子交 换层析
凝胶 亲和 疏水 过滤 层析 层析
吸附 层析
细
分
离
精制后的蛋白质
四 蛋白质的分离纯化方法
分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用 蛋白质之间的各种特异性的差异，包括： （1）分子大小； （2）溶解度； （3）电荷不同； （4）选择性吸附； （5）对配体分子的生物学亲和力等。
4 温度对溶解度的影响
在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一 定范围（约0-40℃）内是随着温度增加而增加 的。
但在40-50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定 并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解 力。
大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白 质的分级分离操作一般都要求在低温下进行。
（三）根据电荷不同的分离方法
•缺点： 常会使蛋白质变性
•注意事项: 必须在低温下操作 尽量缩短处理的时间
及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去
(3) 重金属盐沉淀法
•原理:
重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+ 等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负 电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋 白盐而沉淀。
若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生
透析与超过滤简易装置
超滤装置
2 凝胶过滤
（1）凝胶过滤的介质
凝胶的网孔大小决定分离范围
能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分 子质量范围
Sephadex G-50 1 500~30 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极 限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量, 如Sephadex G-50的极限为30 000
原理:
以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性 电解质载体，在电场作用下，两性电解质 载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质 在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动 而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电 聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE， IEF-PAGE)
1 . 电泳
电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的
蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以 分开。
F=Ff
qE=fV
泳动度 µ=v/E
电泳的发展
a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进 行电泳。
b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲 液的支持物上进行电泳，不同组分形成 带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖 、聚丙烯酰胺）作支持物。
应用:
(1)蛋白质分离纯化 (2)解毒 (3)临床检验
引起蛋白质沉淀的原因
1、加入脱水剂以除去它的水化层。 2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失
去携带相同净电荷。 3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝
集成大的质点而沉淀。
水化层
蛋 白 质
+++
酸
碱
－－
－
－
胶
+
+碱
体
++
酸
－ －－
－
第五章 蛋白质的通性、纯化和表征
≤目的要求≥
1、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。 2、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白
质分离纯化方法。 3、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。
≤重点难点≥
1、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。 2、蛋白质的分离纯化方法。
一、蛋白质的酸碱性质
1. 蛋白质分子的可解离基团
（1） PAGE： PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳 凝胶板分为两部分：
PAGE
浓缩胶
垂 直
平
板
电
分离胶
泳 示
意
图
PAGE的三种分离效应
分子筛效应 电荷效应 浓缩效应
•高效的分辨率
（2）等电点聚焦
蛋白质是两性电解质
当pH=pI时净电荷为零，在电场中既 不向正极也不向负极移动，此时的 pH就是该蛋白质的等电点(pI)