实验五线粒体和细胞核的制备与观察.

1.试剂 1）分离介质：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（pH7.4），3 mmol/L EDTA， 0.75 mg/ml BSA。 2）保存液：0.3 mol/L 甘露醇（pH7.4）。 3）20% NaClO溶液。 4）1% 詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 2.器材 剪刀，漏斗，研钵，纱布，离心管，显微镜， 冷冻高速离心机等。
0.15
2700rpm 13365rpm
涂片过程：
3. 分离物鉴定： （1） 细胞核：将涂片①③自然干燥后加入 Carnoy固定液15min，晾干。Giemsa染液染 10min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水，用显微 镜（40×）检查，细胞核呈紫红色，混杂的细胞 质为浅蓝色碎片。 （2） 线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，得涂 片②④，勿太密。滴加1%詹纳斯绿B溶液染色， 10分钟后用光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色， 小棒状或哑铃状。
实验五：线粒体和细胞核的制备 与观察
一、实验目的 1.对分离得到的细胞核及线粒体进行 活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备植物 细胞核及线粒体的方法。
二、实验原理 线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重
要细胞器。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬 浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一 定的离心场中（选用离心机的一定转速），球形 颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介 质的粘度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间， 组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降 速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离 心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、 轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细 胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和 其他微体、核糖体和大分子。
四、实验步骤 (一) 鼠肝细胞线粒体及细胞核的分离
1.制备肝细胞匀浆： 实验前将小白鼠空腹12小时，脱臼处死，剖腹取
肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取 肝组织0.15g，剪碎；用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗 涤3次。然后加1.5 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液，分 数次添加蔗糖溶液，在冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成 匀浆，肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片①②).
(二) 玉米线粒体及细胞核的分离 从植物细胞分离线粒体，除了作线粒体功能
研究外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核 外基因――线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数 离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘 露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后 细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛 血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为竞 争性底物削弱蛋白酶的作用。
细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组
分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分 布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料 保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显 色，而胞质中的染料被还原成无色。
詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞 或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料 （碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶 粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴 离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被 堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结 构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任 何物理、化学变化以导致细胞的死亡。
3.实验方法 1）剪取1～2cm长的幼苗黄化苗0.5g，剪碎；加2.0 ml预 冷的分离介质，冰浴上研磨成匀浆。 2）匀浆用双层纱布过滤. 3）滤液2700rpm离心10分钟，除去核和杂质沉淀,制涂片 ①。 4）上清夜13365rpm离心15分钟，沉淀为线粒体。制涂片 ② 5）涂片①②未干时，立即滴加1% 詹纳斯绿B染液，染色 10分钟，盖上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆 形颗粒。
差数离心技术：利用细胞核与线粒
体在一定介质中的沉降速度的差异，可 采取分级差速离心的方法，将细胞核与 线粒体逐级分离出来。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液， 它较接近细胞质的分散相，在一定程度 上能保持细胞器的结构和酶的活性； pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集 成团，有利于分离。整个操作过程样品 要保持在0℃∽4℃，避免酶失活。
Hale Waihona Puke Baidu
五、实验结果
光学显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或 哑铃状。
六、实验报告 1.分别描述2张细胞核涂片的结果(如平均每个视野中 所见完整的细胞核数量，完整的细胞或带有残留细胞 质的细胞核的约占多少等) 2.分别描述鼠和水稻黄化苗的两张线粒体装片的观察 结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的纯度 如何? 3.比较动物和植物线粒体的差异。
Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染 料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料 离子。
三、实验材料、用品 器材： 解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙
织物，离心管，显微镜，冷冻高速离心 机等。 2. 材料： 小白鼠，玉米黄化苗
3. 试剂： (1) 0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷 (Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) (2) 1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液。 (3) 姬姆萨染液（Giemsa）。 (4) 1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH6.8） (5) 卡诺（Cornay）固定液。 (6) 生理盐水