DNA的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳的应用
用于分子量较大的样品，如大分子核酸、 用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分 分子量较大的样品 现广泛应用于核酸的研究中。 离。现广泛应用于核酸的研究中。 按相对分子质量大小分离DNA 的凝胶电泳技术，是分析 的凝胶电泳技术， 按相对分子质量大小分离 鉴定基因工程重组DNA 分子的重要实验手段。 基因工程重组 分子的重要实验手段。 鉴定基因工程重组 是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸 是现在通用的许多分子生物学研究方法， 分子生物学研究方法 核苷酸 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础， 序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科 学界的高度重视。 学界的高度重视。
DNA在电场中的迁移率的影响因素 DNA在电场中的迁移率的影响因素
1）DNA的分子大小、形状、构象。 ） 的分子大小、 的分子大小 形状、构象。 2）琼脂糖的浓度。 ）琼脂糖的浓度。 3）所加电压。 ）所加电压。 4）嵌入的染料。 ）嵌入的染料。 5）电泳缓冲液的组成。 ）电泳缓冲液的组成。
琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB） 可用溴化乙啶 琼脂糖凝胶电泳分离后的 可用溴化乙啶（ ） 染色。 染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之 双螺旋结构的两个碱基之 溴化乙啶分子可插入 形成一种荧光络合物。 间， 形成一种荧光络合物。 在 254nm波长紫外光照 波长紫外光照 射下，呈现橙黄色的荧光 橙黄色的荧光。 射下，呈现橙黄色的荧光。 用溴化乙啶检测DNA，可检出 -9g以上的 ，可检出10 以上的 以上的DNA含量。 含量。 用溴化乙啶检测 含量
例如：普通琼脂凝胶电泳，很难分离大于 分子。 例如：普通琼脂凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA 分子。 的 如何研究超大片段DNA？ ？ 如何研究超大片段
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子 电泳槽 取液器
溴酚蓝
试 剂
1、Tris-硼酸 、 硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取 缓冲液（ 缓冲液） 硼酸 缓冲液 缓冲液 ： 10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于去离子水， 硼酸， 溶于去离子水， ， 硼酸 定容至1000mL。 。 定容至 2、琼脂糖： 1g 溶于 、琼脂糖： 溶于TBE缓冲液中加热配成 缓冲液中加热配成100mL。 缓冲液中加热配成 。 3、0.05%溴酚蓝 、 溴酚蓝-50%甘油溶液（5×Loading Buffer ） ： 甘油溶液（ 溴酚蓝 甘油溶液 取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 溴酚蓝水溶液 甘油混合而成 取一定量的 溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 4、 0.5µg/mL溴化乙啶染色液 ： 称取5mg溴化乙啶， 用去 、 溴化乙啶染色液： 称取 溴化乙啶， 溴化乙啶染色液 溴化乙啶 离子水溶解，定容至100mL。从中取 离子水溶解，定容至 。从中取1mL，用无离子水稀 ， 释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。） 释至 。 有毒，戴手套，通风柜内进行。
DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳
一、实验原理
电泳（electrophoresis） 电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作 用下发生定向泳动的现象。 用下发生定向泳动的现象。 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进 是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别 行分离的方法。 行分离的方法。 根据其载体介质的不同可分醋酸纤维薄膜电泳、聚丙 根据其载体介质的不同可分醋酸纤维薄膜电泳、 醋酸纤维薄膜电泳 烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等 烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。 琼脂糖凝胶电泳。 核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳 核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。
注 意 勿使样品槽破裂
3、加样 、
将待测DNA样品液与 ×Loading Buffer以4：1的体 样品液与5× 将待测 样品液与 以 ： 的体 分别加人到凝胶板的加样槽内。 积比混合， 移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内 积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每 个糟加10µL左右。 左右。 个糟加 左右 加样时，使样品集中沉于槽底部。 加样时，使样品集中沉于槽底部。 DNA Marker取5µL直接进行加样。 取 直接进行加样。 直接进行加样
四、实验结果 打印凝胶电泳图，贴于实验报告上， 打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实 验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。 的大小。 验结果进行讨论，分析所测未知 的大小
五、课后研讨题 1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 总结本实验操作的关键环节和注意事项。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅 实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性， DNA染料EB具有潜在的致癌性 资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 EB的染料并说明优缺点 3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应 查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应 DNA 用和发展。 用和发展。
琼脂糖凝胶电泳的优点
1）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（98%～99%）， ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（ ～ ）， 近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小， 近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸 附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直 ）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收， 接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱， 接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便 于定量测定。 于定量测定。 3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进 ）操作简单，电泳速度快， 行电泳。 行电泳。
点样时应注意哪些问题？ 点样时应注意哪些问题？
点样位置： 点样位置：靠近负极一端凝胶凹槽 注意移液枪枪头不要损坏凝胶槽 注意移液枪枪头不要损坏凝胶槽 移液枪枪头 点样后在凹槽内移液枪不能倒吸 点样后不能再移动电泳槽位置
4、电泳 、
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极， 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连 接正极，接通电源，开始电泳。 接正极，接通电源，开始电泳。 样品进胶后，应控制电压降不高于5V／ 样品进胶后 ， 应控制电压降不高于 ／cm(电压值 电压值 V／电泳板两极之间距离比 。当溴酚蓝条带移动到距离 ／电泳板两极之间距离比)。 凝胶前沿约lcm时，停止电泳。 时 停止电泳。 凝胶前沿约
DNA分子在 值高于其等电点 的溶液中带 负 分子在pH值高于其等电点的溶液中带负 分子在 值高于其等电点的溶液中带 电荷， 在电场中通过琼脂糖凝胶向阳极 移动。 阳极移动 电荷 ， 在电场中通过琼脂糖凝胶向 阳极 移动 。
TBE缓冲液，pH8.3 缓冲液， 缓冲液
不同大小、不同形状和不同构象的 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子 大小 形状和不同构象 在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、 在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、 电压、缓冲液等），有不同的迁移率， ），有不同的迁移率 电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以 可通过电泳使其分离。 可通过电泳使 、 2、直流稳压电泳仪 、 3、微量移液枪 、 4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶 、凝胶成像系统：可发射紫外光， 图像的实时观测
三、操作方法
琼脂糖， 1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，置于三角烧 琼脂糖凝胶液的制备： 瓶中，加入 缓冲液， 瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯， 缓冲液 瓶口扣上一小烧杯， 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为 琼脂 加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂 至微沸 糖。
5、DNA Marker 、 DL2,000TM DNA Marker （TaKaRa公司） 公司） 公司
为已含有1× 本 Marker为已含有 ×Loading Buffer的DNA溶液 为已含有 的 溶液 可取5µL直接电泳 可取 直接电泳 6、大小未知的待测DNA溶液 、大小未知的待测 溶液
待凝固完全后， 待凝固完全后 ， 用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液 润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板， 润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶 板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电 板上形成相互隔开的样品槽 将凝胶连同水平板放入电 泳槽平台上。倒入TBE缓冲液直至浸没过凝胶面 缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。 泳槽平台上。倒入 缓冲液直至浸没过凝胶面 。
5、染色 、 将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中， 将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中， 室温下浸泡染色30min。 室温下浸泡染色 。
特别注意： 特别注意： 溴化乙锭是DNA诱变剂和致癌物质，配制和使用EB DNA诱变剂和致癌物质 溴化乙锭是DNA诱变剂和致癌物质，配制和使用EB 染色液时，应戴乳胶手套， 染色液时，应戴乳胶手套，不要将该溶液洒在桌面或地 面上。凡是沾污过溴化乙锭的器皿，必须经专门处理后， 面上。凡是沾污过溴化乙锭的器皿，必须经专门处理后， 才能进行清洗或弃去。 才能进行清洗或弃去。
注 意 要完全融化混匀
2、凝胶板的制备 、
置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子） 置水平板于工作台面上 ， 将样品槽模板 （ 梳子 ） 插进水 平板上凹槽内， 距一端约0.5cm。 梳子底边与水平板表 平板上凹槽内 ， 距一端约 。 面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至 ℃左右，小心 的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右， 面保持 的间隙 地倒入托盘内， 地倒入托盘内 ，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一 层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。 层约 厚均匀胶层。静置 小时。 厚均匀胶层 小时 注 意 液内不存有气泡
6、观察与拍照 、
小心地取出凝胶置托盘上， 小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表 面的溴化乙锭溶液， 面的溴化乙锭溶液 ， 再将胶板推至凝胶成像系统的 样品板上，在紫外灯下进行观察。 样品板上，在紫外灯下进行观察。 DNA存在的位置呈现橘红色荧光 ， 肉眼可观察 存在的位置呈现橘红色荧光， 存在的位置呈现橘红色荧光 到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。 到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。