川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

生物技术综合实验

甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达

学生：学号：

同实验者：

<研究背景>

谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。

实验一甘薯叶片RNA提取

一、实验目的

1. 了解真核生物RNA提取的原理；

2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。

二、实验原理

Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA

的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。

1.材料

甘薯（Ipomoea batatas Lam）叶片，品种为徐薯18

2. 试剂

① 无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；

② Trizol试剂；

③ 氯仿；

④ 异丙醇、75％乙醇；

⑤ TBE缓冲液；

⑥ 上样缓冲液（6×）

3. 仪器

高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP管架

四、实验方法

1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；

2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min 使其自然分相；

3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；

4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；

5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；

6. 室温放置10 min晾干沉淀；

7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；

8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。

1.RNA提取结果

依照Trizol?试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。

2. RNA后电泳结果

如图1. 其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。

图1. RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。

六、分析与讨论

1. RNA的提取

产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。

2. RNA电泳结果

有EB存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另

出现条由tRNA， rRNA和5S rRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28S rRNA的亮度应为18S rRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1. 9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。

在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。

七、总结：

本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1. 2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可知，琼脂糖凝胶质量以及试剂对结果干扰不大。那么本小组成员在提取过程中的操作一定出现了很大失误。首先口罩、手套应该严格按规定佩戴，提取过程对移液枪等仪器使用需谨慎仔细，尽量避免混入杂质。其次为排除部分杂质影响可对RNA样品用紫外线分光光度计测定吸光值检验，将有助于结果分析。最后，细节决定成败，我们应汲取教训避免接下来的实验出现类似问题。

实验二第1链cDNA的合成和模板的验证

一、实验目的

1.掌握第1链cDNA的合成方法和步骤

二、实验原理

真核生物基因多为断裂基因，编码区不连续，需经转录后加工才能成为成熟mRNA。以真核成熟mRNA为模板合成cDNA，进而获得有连续氨基酸编码的DNA序列，无需转录后加工，即可在原核细胞中表达。

真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18个T）。莫洛尼