RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
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内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
（1）配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组
反应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系(见下表) 注意：1.目的片段与载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效
率会降低；2.反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应
试剂
加量
10x Buffer
利用内切酶消化难以得到相应的产物。
➢ 方法看似简单，但实验周期长。
➢ 大片段难以与载体正确连接。
➢ 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。
限制性内切酶
连接酶
同源重组克隆步骤
步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体
步骤3: 目的片段与载体连接
步骤4: 重组子转化到感 受态细胞 传统克隆步骤
同源重组克隆与传统克隆比较
三重同源重组示意图
cry1Ac的启动子片段和 终止子片段“一步”重 组入pHT315质粒上
2. 四重同源重组（Quadruple recombineering）
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
1ul
Recombination Enzyme 1ul 线 性 化 载 体 （ >50ng/ul）50-100ng 插入片段（>50ng/ul） 150-200ng
（2）短暂离dd心H混2O匀，37℃孵育15分补钟足。至10ul
（3）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在4℃或
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
2. 线性供体dsDNA底物的制备
选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
来自百度文库
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建 议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。
不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需>50ng/ul，高浓度的载体有 利于提高效率。
4. 同源重组反应
-20℃保存待用。
5.重组产物转化至感受态细胞
注意：所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg. 冰上融化一管100 μl的DH5α感受态细胞。
加入5-10μl反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育 30分钟。
42℃水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。
加入890μl SOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
EcoRV
EcoRV
PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse
p15A-cm Cluster A
(38015 bp)
异源表达
七、 Red/ET重组新技术的发展 1. 三重同源重组（Triple recombineering）
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
克隆片段 长度
一次克隆 片段数
感受态效 率要求
所用的酶
片段的插 入位点
片段酶切
载体线性 化方法
同源重组克隆 50bp-10kb
传统克隆 50bp-2kb
1-5个
1个
1×108cfu/ug以上 1×107cfu/ug以上
重组酶 任何位点
T4连接酶 特定位点
不需要 酶切或PCR
需要 酶切
2. 染色体的修饰
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
6. 重组子筛选
复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培养12-16h 后观察菌落生长情况。 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：
在10μg/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60μg/mL的卡那霉素平板上 重组子的数目的6倍。
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、
HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物；
纯化PCR产物：
（1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系
常用抗生素的工作浓度
7. 重组子的检测
检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等；
一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选 择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象；
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
（1）配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组
反应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系(见下表) 注意：1.目的片段与载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效
率会降低；2.反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应
试剂
加量
10x Buffer
利用内切酶消化难以得到相应的产物。
➢ 方法看似简单，但实验周期长。
➢ 大片段难以与载体正确连接。
➢ 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段。
限制性内切酶
连接酶
同源重组克隆步骤
步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体
步骤3: 目的片段与载体连接
步骤4: 重组子转化到感 受态细胞 传统克隆步骤
同源重组克隆与传统克隆比较
三重同源重组示意图
cry1Ac的启动子片段和 终止子片段“一步”重 组入pHT315质粒上
2. 四重同源重组（Quadruple recombineering）
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片
段的消化。
Digestion Binding
3’ 5’
Reda(RecE)
Redb(RecT) Single-strand
annealing
3’ 5’
Strand invasion
Repair/Replication
Selection
1ul
Recombination Enzyme 1ul 线 性 化 载 体 （ >50ng/ul）50-100ng 插入片段（>50ng/ul） 150-200ng
（2）短暂离dd心H混2O匀，37℃孵育15分补钟足。至10ul
（3）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在4℃或
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
2. 线性供体dsDNA底物的制备
选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
力，增加电转化效率。
五、 Red/ET重组操作流程
引物设 计合成
线性供体dsDNA 底物的制备
线性载体的 制备
重组子 筛选
来自百度文库
重组产物转化 至感受态细胞
重组子检测
重组反应
1. 设计合成引物
设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。 （2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括3’ 端突出序列的同源序列。
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建 议用高保真的聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。
不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需>50ng/ul，高浓度的载体有 利于提高效率。
4. 同源重组反应
-20℃保存待用。
5.重组产物转化至感受态细胞
注意：所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg. 冰上融化一管100 μl的DH5α感受态细胞。
加入5-10μl反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育 30分钟。
42℃水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。
加入890μl SOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
EcoRV
EcoRV
PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse
p15A-cm Cluster A
(38015 bp)
异源表达
七、 Red/ET重组新技术的发展 1. 三重同源重组（Triple recombineering）
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
Red同源重组原理示意图
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
克隆片段 长度
一次克隆 片段数
感受态效 率要求
所用的酶
片段的插 入位点
片段酶切
载体线性 化方法
同源重组克隆 50bp-10kb
传统克隆 50bp-2kb
1-5个
1个
1×108cfu/ug以上 1×107cfu/ug以上
重组酶 任何位点
T4连接酶 特定位点
不需要 酶切或PCR
需要 酶切
2. 染色体的修饰
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
6. 重组子筛选
复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培养12-16h 后观察菌落生长情况。 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：
在10μg/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60μg/mL的卡那霉素平板上 重组子的数目的6倍。
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、
HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物；
纯化PCR产物：
（1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系
常用抗生素的工作浓度
7. 重组子的检测
检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等；
一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定。为避免假阳性结果，鉴定引物选 择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物。
高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象；